NGS检测ALK融合大起底--转载

导读：

ALK融合是非小细胞肺癌的关键驱动机制之一，在NSCLC患者中发生的频率约为3-7%。针对ALK融合的抑制剂克唑替尼、色瑞替尼以及Alectinib在治疗ALK融合阳性的NSCLC患者中都取得了巨大成功，而ALK融合检测是靶向ALK治疗的前提。

1．传统ALK检测技术的特点及不足之处

目前对ALK融合的检出方法包括传统的荧光原位杂交（FISH），基于PCR扩增技术（RACE-PCR或RT-PCR联合测序技术、qRT-PCR等）和免疫组织化学法（IHC），这些传统方法各有其优缺点（表1）。传统ALK融合检测技术在临床中为ALK阳性肺癌患者带来了巨大获益，然而传统的检测技术只能通过肿瘤组织检测也限制了其进一步推广，很多晚期肺癌患者无法进行手术获取组织样本，因此无法使用传统检测技术检测ALK状态。

	FISH	IHC	RT-PCR
敏感性	10-15%	5-10%	1-5%
检测费用	高	低	高
检测层面	DNA水平	蛋白水平	RNA水平
是否可同时检测其他类型突变	否	否	否
所需材料	组织	组织	组织
不足之处	操作要求高、价格昂贵、尚不适用于ALK融合阳性患者的筛查	判定标准主观、无法直接检测融合基因	无法检测未知的融合型、对RNA质量要求高

表1 检测方法特征比对

2. 下一代测序技术（NGS）在检测ALK融合检测中的应用

随着NGS技术的快速发展，ALK融合检测迎来的新的转机。NGS技术不仅可以检测组织样本中的ALK融合，同时可以通过血浆和胸水样本检测ALK融合状态；此外，NGS检测技术灵敏度也远高于目前传统检测技术，可以检出0.1%以下的ALK融合；并可以进行DNA、RNA多层面检测以确保检测准确性。越来越多的患者通过NGS检测ALK融合状态获得临床用药指导，实现临床受益。

NGS检测ALK融合相比传统ALK检测技术优势显著，而全面的NGS质控是NGS检测数据的质量保证，特别是在血浆中检测极低丰度的ALK融合，对NGS质控提出了更高的要求。其中可靠的ALK基因捕获探针是进行高精准测序的前提和重要一环，ALK融合通常发生在ALK基因内含子区域，因此要求检测探针全面覆盖ALK基因外显子区域和内含子区域。从下面IGV图的对比中，可以看出探针覆盖均一性的重要性，图一为世和高覆盖度的探针，图二为未完整覆盖的探针，在图二红圈中探针缺失的区域就成为了测序的“盲区”，无论测序深度有多高，都无济于事，因为在基因捕获过程中就已经遗漏这一重要区域。所以对于NGS检测来说，每一个环节都需要“精益求精、慎之又慎”，不能存在短板，也更不能一味的只是强调“测序深度”这一概念。

图1：ALK基因19内含子探针覆盖度，

显示出高度均一性

（来自：世和基因）

图2：ALK基因19内含子探针有覆盖“盲区”

世和基因通过前期14轮的优化流程，不断改善ALK基因的覆盖情况，实现了对ALK基因全外显子和内含子的全面密集覆盖，为NGS在ALK融合检测中提供了技术保障，保证了ctDNA中极低丰度的ALK融合检出率。在世和前期检测的938例肺癌患者中，ALK融合的检出率为5.9%，与目前已经报道的ALK融合检出率相符合，其中常见ALK融合占比为88%，还有12%未报道的罕见ALK融合被检出，有些是EML4与ALK基因的罕见融合位点，有些是EML4以外的其它罕见融合伴侣；并且在同时检测肿瘤组织和ctDNA的样本中，ctDNA检测与组织检测比对敏感性超过90%，可以作为ALK组织检测的有效补充。

ALK融合基因突变，占肺癌中的5%左右。克唑替尼可以靶向治疗有ALK融合基因突变的肺癌。

本视频介绍了该种基因突变，和相关的靶向治疗药物，以及针对性的临床基因突变检测方法。

视频时长14分钟，建议在Wifi条件下观看：

 

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欢迎来到【陈巍学基因】。我们这个节目，主要是给大家介绍基因组学，和临床分子诊断的最新技术进展。

今天，会和大家谈一下ALK基因。之所以要谈ALK基因，是因为ALK基因的突变，参与多种肿瘤的发生。并且在针对肺癌的靶向治疗当中，ALK的融合基因突变是一个重要的靶向治疗标志物。

今天，我们会按照如下的顺序来介绍ALK基因:

l  ALK基因和蛋白的结构与功能

l  ALK基因在肿瘤当中的突变

l  针对ALK基因突变的肿瘤靶向治疗药物

l  针对ALK融合基因突变的临床检测

一共分成4个方面来谈

结构与功能

ALK基因的全名是：Anaplastic lymphoma kinase。翻成中文，是“间变性淋巴瘤激酶”。

ALK基因位于2号染色体的短臂上，包含29个外显子，编码一个1620个氨基酸残基的蛋白质。ALK蛋白是胰岛素受体家族中的一员。ALK蛋白是一个跨膜的、酪氨基激酶的单体。

刚刚翻译出来的时候，是177KD。然后，蛋白的N端被加上糖链，分子量达到200KD。再被转运到细胞膜上。

ALK蛋白的N端露在细胞膜外面，N端的功能是接受外界配体的信号。中间段是跨膜部分。C端位于细胞内，是有酪氨酸激酶功能的结构功能域。

野生的ALK蛋白，2个蛋白单体组成一个ALK的二聚体，经过配体的激活，二聚体的两个亚基之间相互磷酸化，二聚体变成有激酶活性的酪氨酸激酶。但是，请注意这是没有突变的ALK蛋白的激活过程，突变的ALK蛋白不遵循这样的激活过程，在后面我们会详细介绍。

在哺乳类动物当中，正常情况下，ALK基因主要在胎儿期间进行表达。出生之后，只在神经系统还有少量的表达。在神经系统之外，就很少有表达了。

ALK的上游配体有pleiotrophin（PTN）和midkine（MK）。这两种配体可以激活ALK蛋白，但是当ALK发生变异之后，ALK就可以不依赖上游的配体，直接激活下游的信号通路。

ALK基因的突变

接下来，我们就来谈ALK基因的突变。

ALK基因的突变，主要有三种形式：

l  第1种，是点突变

l  第2种，是拷贝数异常增加

l  第3种，是染色体异位，ALK基因与别的基因形成融合基因

第1类，ALK的点突变，最常见的是F1174L和R1275Q，这两种点突变。在发生了这类点突变之后， ALK就不需要配体激活，直接就可以激活下游信号通路。

在成神经细胞瘤（Neuroblastoma）当中，有6～8%的病例会有ALK的激活点突变。但是在其它器官的肿瘤当中，较少发现有ALK的点突变。

第2类（突变），ALK基因拷贝数异常增加。在成神经细胞瘤当中，约4.4%的病例会有ALK基因的拷贝数异常增加，在肺癌当中，也会有一部分的病例有ALK基因的拷贝数增加。而且有ALK的拷贝数异常增加的病例，往往会伴随有ALK的激活点突变。那么ALK基因的拷贝数的异常增加，自然会异常地增加ALK蛋白的产量。

第3类突变，ALK融合基因突变。这是我们今天要重点介绍的突变类型。

我们这里先介绍一下“融合基因”的概念。A和B两个基因，原来在染色体上是分开的，或者根本就在二条染色体上。现在因为某种原因，比如受到电离辐射的照射之后，染色体发生重排。把A基因的头部，和B基因的尾部，连在了一起，形成一个新的基因。这个有着A基因的头部，和B基因尾部的新基因，就叫做“融合基因”，英文叫“fusiongene”。

融合基因会同时拥用原来A基因和B基因各自的一些特点。例如：融合基因在什么组织当中进行表达、表达多少量，一般会与A基因原来的表达情况相似。同时，如果原来B基因的尾部有激酶活性，那么新的融合基因产生的蛋白，也可能会拥有激酶活性。

对于ALK基因来说，产生融合基因突变，是很重要的一种致癌基因突变形式。

目前已知，ALK会与20多种基因形成融合基因，其中最常见的有2种：

l  第1种是，EML4-ALK融合基因

l  第2种是，NPM-ALK融合基因

在肺癌当中，有3～7%的病例是有EML4-ALK的融合基因突变的。而且有EML4-ALK融合基因突变的病例，主要是肺腺癌。发生ALK融合基因突变的肺癌病人，多数是不吸烟的人。在肺癌当中，EML4-ALK是最常见的ALK融合基因突变类型。除EML4-ALK之外，肺癌当中，还有少量的KIF5B-ALK、TFG-ALK等其它的ALK融合基因突变类型。

在EML4-ALK融合基因突变当中，已知有20多种亚型。这些亚型之间的区别，主要在于EML4基因的断点不同；而ALK基因的断点，绝大部分都落在第19号外显子与第20号外显子之间的那个内含子上。

在这些融合基因当中，EML4的基因头部以及5’端上游的部分序列，让融合基因在肺腺细胞当中得以高表达。同时，ALK的基因尾部的那个酪氨酸激酶功能区域，让融合基因有了酪氨酸激酶的功能。并且这种酪氨酸激酶活性无需上游配体的激活。

在间变性大细胞淋巴瘤（anaplastic large cell lymphoma，ALCL）当中，发现60～84%的病例会有ALK的融合基因突变。其中主要的突变类型是NPM-ALK突变。

在炎性肌纤维母细胞瘤（inflammatory myofibroblastic tumor，IMT）当中，50～60%的病例，有TPM3-ALK或者TPM4-ALK融合基因突变。

在其它组织器官的肿瘤，例如乳腺癌、结直肠癌等癌症当中，也有一定比例的ALK融合基因突变。

综上，我们发现，ALK只有在成神经细胞瘤当中，会以点突变的形式，成为致癌突变。而在别的组织来源的肿瘤当中，主要是通过形成融合基因的形式，成为致癌突变。而且在不同的组织来源的肿瘤当中，我们发现有不同的基因与ALK形成融合基因。

我个人对这个现象的理解是：

• 第1，在神经组织当中，天然有ALK基因的表达，所以只要ALK基因发生激活点突变，就有可能会诱发癌症

• 第2，人在出生之后，除神经之外的其它组织当中，ALK基因天然是不表达的，所以就算ALK基因有激活点突变，因为不会被翻译成蛋白，那么点突变也就不会发生作用，更不会致癌

• 第3，在除了神经组织之外的其它组织当中，只有当ALK基因被配上了一个在该组织中高表达的启动子，ALK才能变成蛋白，并因此诱发癌症

• 第4，因为在不同的组织当中，高表达的启动子是不同的，所以在各种不同组织来源的肿瘤当中，被发现的那个与ALK融合的基因是组织特异的。例如：在肺癌当中，主要是与EML4基因融合；在间变性大细胞淋巴瘤（ALCL）当中，主要是与NPM基因融合；而在炎性肌纤维母细胞瘤（IMT）当中，主要是与TPM3或者TPM4基因融合。因为只有在特定组织当中高表达的那个启动子，才会让融合基因在这个组织当中得以高表达。ALK才能变成蛋白，发挥激酶作用。

并且最终诱发癌症。

反之，如果是一个在特定组织当中不表达的启动子，接到了ALK上，那么，这个融合基因就不会在这个组织当中进行表达，更不会翻译成蛋白，也就不会诱发癌症，那么这个突变也就不会被科学家注意到。

突变的ALK蛋白所参与的激活的下游信号通路十分广泛。现在已知它会参与的信号通路有：

l  RAS-MAPK通路

l  PI3K-AKT通路

l  第3，PLCγ通路

l  第4，JAK-STAT通路

以及多个其它通路

这些信号通路，最后都是导向：细胞增殖、抵抗凋亡、促进血管生成，最终会诱发癌症。

针对ALK突变的肿瘤靶向药物

2011年FDA批准克唑替尼（辉瑞公司药品，crizotinib，商品名：Xalkori），可以用于晚期的、有ALK融合基因突变的肺癌的治疗。

克唑替尼是一种小分子的，酪氨酸激酶抑制剂类（TKI）的药物，它可以特异地抑制ALK融合蛋白、和ROS1融合蛋白的酪氨酸激酶活性。

有ALK融合基因突变的非小细胞肺癌的病人，经克唑替尼的治疗，客观反应率达到60%以上。其中50%以上的病人的无进展生存期可以达到7个月、或者更长。

2014年FDA批准Ceritinib（诺华公司药物，商品名：Zykadia），可以用于克唑替尼治疗无效、或者不能耐受克唑替尼的，并且有ALK融合基因突变的，非小细胞肺癌病人。

ALK融合基因突变的临床检测

到目前为止，得到批准的、检测ALK融合基因突变的临床检测方法有三种。

第一种，是FDA在2011年8月批准的，雅培公司基于FISH方法的检测试剂盒。这个检测试剂盒的原理，是在ALK基因的3端，设计红色的荧光探针；在ALK基因的5端，设计绿色荧光探针；然后对肿瘤样本做FISH荧光探针杂交检测。

如果检测的结果当中，红色光点和绿色光点是连在一起的，那么说明ALK没有发生断裂，也就是ALK没有发生融合基因突变。反之，如果红色光点与绿色光点是分离的，那么就说明肿瘤当中，ALK基因发生了断裂，也就是有ALK融合基因突变。

到目前为止，雅培的这个FISH检测ALK融合基因突变方法，还是临床上检测ALK融合基因突变的金标准。但是FISH方法的检测成本较高。

2015年7月，FDA批准罗氏公司推出的Ventana ALK 免疫组织化学的检测方法，可以用于检测ALK的融合基因突变。

这是第二种获得FDA批准的，ALK突变检测方法。

罗氏的这个方法，是通过检测肿瘤组织当中，是否有过量的ALK蛋白的表达，来检测ALK是否有突变的。

罗氏的这个检测方法，它区别于传统免疫组化方法的特点是：

第1，它用兔单克隆抗体（anti-ALK (D5F3)）来检测ALK抗原，而不是用鼠单抗、或者兔多抗来检测ALK抗原，所以检测的特异性会很高。

第2，它用级联信号放大的方法，把检测到的信号放大

所以它的灵敏度会高于一般的免疫组化检测方法。

罗氏的这个方法的特点是简便易行，检测成本相对较低。

第三种临床上用的检测方法，是用RT-PCR的方法来检测ALK的融合基因，

厦门艾德公司有2个可以检测ALK融合基因的检测试剂盒，都获得了中国CFDA的批准，这两个试剂盒的工作原理。

都是先把肿瘤组织当中的RNA逆转录成cDNA，然后再用针对融合基因的PCR探针，来进行实时荧光定量PCR扩增。如果荧光定量PCR能探测到荧光，就说明有融合基因突变，如果不能探测到荧光，则说明样本中没有目标基因突变。或者目标突变的比例极低，低于试剂盒的检测灵敏极限。

RT-PCR方法的好处是：方法成熟、简便易行、灵敏度高。

它的不足之处是，只有试剂盒当中对应探针的突变形式，才能被检测到，没有对应探针的突变形式，就不能被检测到。另外RT-PCR的方法，对RNA样本质量的要求比较高，如果RNA样本有严重降解，则检测的灵敏度会下降。