MCP|LDY|Mass Spectrometry-based Absolute Quantification of 20S Proteasome Status for Controlled Ex-vivo Expansion of Human Adipose-derived Mesenchymal Stromal/Stem Cells（基于质谱技术的20S蛋白酶体绝对定量方法监控人体脂肪...

期刊名：Mol Cell Proteomics

发表时间：（2019年4月）

IF：5.232

 

概述

20S蛋白酶体是一种多亚基蛋白质复合物，参与许多组织细胞生命活动过程。本研究基于SILAC标记的蛋白酶体的MRM技术，以监测人体不同组织细胞中20S蛋白酶体亚型的绝对表达量。并将这种高准确性的SILAC标记的多重LC-选择反应监测(SRM)定量质谱分析方法，应用于对不同培养条件下体外扩增脂肪来源间充质干细胞（ADSCs）中的20S蛋白酶体表达量的监测，结果发现IFNγ刺激或20%常氧环境培养ADSCs使其免疫型蛋白酶体表达量上调。

研究背景

蛋白酶体是一种多亚基复合物，能通过蛋白质降解调控多种细胞生命活动，近年来已被确定为肿瘤学中的治疗靶标。由于缺乏一种能直接准确定量生物样品中总体蛋白酶体状态的技术方法，对蛋白酶体功能的理解和相应特定调节剂的开发而受到阻碍。本研究开发出一种针对普遍存在且具组织特异性人20S蛋白酶体亚型的绝对定量和化学计量的方法，此方法基于SILAC标记的多重LC-选择反应监测（SRM）定量质谱分析，具有高精度，高准确性和灵敏度。该方法最初通过与ELISA测定法比较，在人体组织细胞范围内，通过对HeLa细胞IFNγ刺激前后催化亚基的动力学进行优化和验证。然后成功应用于揭示脂肪来源间充质干细胞（ADSCs）原代培养过程中根据IFNγ或不同O2浓度等培养条件对其蛋白酶体状态的依赖性变化。若标准蛋白酶体向免疫蛋白酶体的转变可以作为ADSCs免疫抑制和分化能力的预测指标，那么除了监测细胞质量控制的一些必需参数外，还应包括蛋白酶体定量。这种具有高准确性的绝对定量方法可作为一种新的且强有力的工具，用于在癌症或炎性疾病中进行更多个体化方案的把控。

实验设计

研究成果

1、人体组织细胞中至少存在六种不同形式的20S蛋白酶体。 标准20S蛋白酶体（sP20S）由亚基（α1-α7，β3，β4，β6，β7）与催化亚基（β1，β2，β5）组成，在大多数细胞类型中含量最为丰富。免疫细胞20S蛋白酶体中至少含有一个免疫型催化亚基，此催化亚基可由炎性细胞因子诱导表达。另外还具有一些组织特异性的20S蛋白酶体亚型，如胸腺蛋白酶体（β5t  P20S）与生殖细胞蛋白酶体（α4s  P20S）。为了实现对20S蛋白酶体及其亚基的精确定量，结合IDMS和SRM的工作流程，最后选用较AQUA更具准确性的SILAC标记定量方法，成功在不同来源的八种不同的人源细胞系（HEK 293T，HCT116，RKO，U937，HeLa S3，NB4，KG1a和MRC5）的蛋白质裂解物中实现了总20S蛋白酶

2、SILAC标记的LC- SRM测定方法与ELISA测定方法在多种细胞系的20S蛋白酶体的测量结果上表现出高度相关性，说明此方法适用于人源细胞中20S蛋白酶体的绝对定量。使用IFNγ刺激HeLa细胞结果发现随着时间的增加iP20S亚型逐步替代sP20S。

 

3、应用SILAC标记的LC- SRM测定方法对来源于11种不同组织细胞中的20S蛋白酶体亚型的绝对量和精确化学计量。在大多数组织中，蛋白酶体占所存在的总蛋白的0.2％至1％。Label-free LC-MS/MS鉴定结果发现α4s和β5t在胸腺与睾丸组织中具有特异性，并且这两种20S蛋白酶体亚型分别占组织中总蛋白酶体的20％与12％，但免疫催化亚基（β5i，β1i，β2i）在多种组织中分布，并在抗原递呈中起重要作用。

 

4、MSCs具有免疫抑制作用被认为具有广阔应用前景的细胞治疗工具。IFNγ刺激体外培养扩增ADSCs发现20S蛋白酶体总量无明显变化，但大量标准催化亚基转变为免疫催化亚基，促使标准蛋白酶体逐步转变为免疫蛋白酶体亚型。

5、不同O2浓度条件可影响ADSCs的分化能力及其20S蛋白酶体状态。比较低氧和常氧条件对ADSC扩增的影响（1％vs 20％ O2水平），常氧条件下20S蛋白酶体丰度显著增加，同时三种免疫蛋白酶体催化亚基显著上调，可能是导致P20s ChT活性在常氧条件显著升高的原因。20％O2条件下高水平的免疫蛋白酶体促进ADSC的成脂分化潜能，而在低氧条件下相反。

 

文章亮点

本文旨在开发了一种对具有高度异质性的20S蛋白酶体复合物及其亚基的绝对定量方法，优化了依赖基于SILAC的LC-SRM绝对定量的工作流程。此方法有利于在免疫治疗过程中对患者进行评估，因为肿瘤抗原加工和呈递的功效与抗原呈递细胞中20S免疫蛋白酶体的水平密切相关。此方法可以在体液中监测20S蛋白酶体亚型的变化，作为预测诊断各种疾病的预后标志物。