Journal of Proteome Research | Single-Shot Capillary Zone Electrophoresis−Tandem Mass Spectrometry Produces over 4400 Phosphopeptide Identifications from a 220 ng Sample （分享人:赵伟宁）

Title: Single-Shot Capillary Zone Electrophoresis−Tandem Mass Spectrometry Produces over 4400 Phosphopeptide Identifications from a 220 ng Sample

Journal: Journal of Proteome Research

Published Date: June 10, 2019

DOI: 10.1021/acs.jproteome.9b00244

Reporter: Weining Zhao

Detailed Information:

单针毛细管区带电泳串联质谱实现对220 ng样本中4400多种磷酸肽的鉴定

1. 文章研究概述

蛋白磷酸化是信号转导中最为常见的翻译后修饰方式，其影响了细胞代谢、增殖、分化、凋亡等过程，在机体稳态中扮演着十分重要的角色。然而，现有技术手段在对低丰度磷酸化蛋白质进行表征时仍困难重重。基于质谱分析法的磷酸化蛋白质组学研究能够为用户提供磷酸化基础上复杂网络和功能的数据信息。目前，由于反向色谱-电喷雾-串联质谱法优越的分离性能，目前是磷酸化蛋白质组学研究中的主要手段。但该方法目前仍然面临许多挑战，如对于极性强的短肽段（如含有较多磷酸化位点的肽段）在上样时容易被从色谱柱中过早流出，从而导致获取相应信息较为困难。毛细管区带电泳分离（Capillary Zone Electrophoresis, CZE）是基于分子尺寸及带电量信息对目标肽段进行分离的技术，该方法能够灵敏地监测到肽段电荷及尺寸的变化。本文将CZE技术与配套有高级峰匹配算法（advanced peak determination algorithm）的质谱平台连用，实现了对220 ng样本（来源于小鼠脑部的富集磷酸化肽段）中超过4000种磷酸化肽段的鉴定。相关数据已上传至ProteomeXchange，检索号为PXD012888。

2. 实验流程

2.1 毛细管柱的制备

基于表面负载液体原理的可逆-加成链置换反应，将聚丙烯酰胺包覆于毛细管壁，形成由线性聚丙烯酰胺负载的毛细管分离柱。随后用氢氟酸（HF）对毛细管柱（50 μm i.d./350 μm o.d.）的尖端进行刻蚀。

2.2 待测样本的制备

取成年雌性C57BL/6J鼠的脑部于盐酸胍中均质，随后煮沸。采用BCA试剂盒对样本中蛋白进行定量。取一定量的细胞裂解产物，加入MeOH后，离心，弃上清。将蛋白颗粒溶解于含尿素、Tris、TCEP和氯乙酰胺的buffer中。加入胞内蛋白酶裂解液，于室温下孵育。将初步酶解液稀释至含尿素的Tris中，向体系中加入Trypsin，然后在室温下孵育过夜。样品用TFA滴定至pH 2左右，离心并固相萃取上清液中的肽段。使用含四价钛的磁珠对干燥后的酶解肽段进行富集。

2.3 CZE-ESI-MS/MS对样本中磷酸化肽段进行鉴定

本文采用的CZE系统含有两个高压电源（分别用来控制毛细管柱进样口末端电压和鞘流液储存库中的电压）以及一个电渗流驱动的电喷雾接口。该接口用于连接毛细管柱和质谱分析仪。电喷雾鞘流液中含0.5%的FA以及10%的MeOH。2.2部分中制备的包覆有聚丙烯酰胺的毛细管柱用于CZE分离。CZE过程中采用了动态pH梯度分离技术，能够进一步提高CZE的灵敏度。将富集的磷酸化肽段溶于30 mM碳酸氢铵（pH 8.2）中，背景电解液为1 M醋酸。这种模式可以使得进样操作后，毛细管柱中产生动态的pH梯度，使分离效果更佳。

2.4 质谱操作条件

本文将CZE与不同的质谱平台（Q Exactive HF以及Orbitrap Fusion Lumos Tribrid）连用，进而观察此方法的检测能力。对于Q Exactive HF质谱分析仪而言，采用基于TOP 10的DDA采集，阳离子采集模式，Slens RF level为60，毛细管加热温度设置为300℃；对于Orbitrap Fusion Lumos Tribrid质谱仪而言，分析使用带有自动增益控制的24万分辨率测量扫描，阳离子采集模式。

2.5 数据库匹配和数据分析

原始质谱数据的搜库过程在含有Sequest HT 和MS Amanda 2.0数据库搜索引擎的PD软件上进行。小鼠数据库在UniProt网站下载得到。在Q-Exactive HF质谱仪上获得的数据，precursor tolerance设置为10 ppm，碎片离子tolerance设置为0.05 Da。对于Fusion Lumos质谱仪获得的数据，将precursor tolerance设置为10ppm，碎片离子tolerance设置为0.4 Da。选择完全胰蛋白酶消化，允许两个漏切位点。以脲甲基化（C）为固定修饰。将氧化（M）、脱氨化（NQ）、乙酰化（K）和磷酸化（S、T、Y）作为可变修饰。使用Percolator软件评估数据库搜索结果，以FDR为1%过滤肽段。

以小鼠fasta数据库为参考，在Motif-X网站上进行Motif分析。

3. 结果展示

3.1 进样量对肽段鉴定数量的影响

作者首先探究了进样量对能够鉴定到肽段的数量所产生的影响。图1为进样量与能够鉴定到的肽段数量之间的关系。一般而言，随着进样量的不断升高（至最大柱容量后），能够被鉴定到的肽段数量理论上会达到平台期。而在本研究中，在进样体积为49 nL（97 ng样本）至104 nL（208 ng样本）之间时，被鉴定到的肽段数量持续增加。当进样体积进一步从208 nL（416 ng）升高至402 nL（804 ng）时，被鉴定到的肽段数量反而呈现下降趋势。当注入量为402 nL时，作者将分离时间从100 min延长到140 min，鉴定的磷酸化肽段数量从2168（N=2，RSD=3.4%）增加到为3005 (N = 2, RSD = 0.5%)。但在104 nL的最佳注入体积下，分离时间为100 min时，该数值仍小于3207（N=2，RSD=0.7%）。为保持CZE的高分离效率，CZE的最佳进样体积通常小于毛管总体积的1%。尽管通过动态动态pH梯度一定程度上增加进样量，但考虑到CZE的分离性能，作者选择最佳进样量为100-50 nL。

Figure 1. Relationship between the injection volume and the number of phosphopeptide identifications. Experimental conditions: Q Exactive HF mass spectrometer; 50 μm i.d. × 350 μm o.d. × 100 cm long LPA-coated capillary; 2 mg/mL enriched phosphopeptides from mouse brain digest; 1 M HAc separation buffer; separation voltage of 23.8 kV; spray voltage of 1.8 kV in positive polarity. Error bars are standard deviations of the measurements.

3.2 高级峰匹配算法与Orbitrap Fusion Lumos Tribrid平台连用

由于本文采用的高级峰匹配算法使用了迭代方法，能够增加对肽段带电状态的注释，因此适用于鉴定整个分离空间中不同分布位置的肽段。作者用单次注射的CZE-ESI-MS/MS方法（Orbitrap Fusion Lumos Tribrid平台）从小鼠脑消化液中提取了220 ng的富集磷酸肽，鉴定出4405个磷酸肽和1998个蛋白组，其磷酸化位点确定概率超过75%（图2）。

Figure 2. Single-shot CZE-ESI-MS/MS analysis of phosphopeptides. Experimental conditions: Orbitrap Fusion Lumos Tribrid mass spectrometer; 220 ng of enriched phosphopeptides from mouse brain digest; other conditions are same as in Figure 1.

图3为不同重复组之间的散点图，计算得到的Pearson相关系数为0.974，表明CZE-ESI-MS/MS方法具有良好的重现性和较高的非标记定量精确度。

Figure 3. Scatter plot between the replicates of CZE−MS. The experimental conditions were the same as in Figure 2. The data are plotted in a green−yellow−red−blue color map corresponding to the density of peptides observed for the two runs.

3.3 磷酸化肽段的迁移时间及pKa分布分析

作者分析了含有不同磷酸化位点肽段的迁移时间及pKa分布情况。图4结果表明，未被磷酸化的肽段，其在毛细管柱中的迁移速度比含有磷酸化位点的肽段快。此外，随着磷酸化位点数的增加，肽段的迁移时间增加。上述结果提示我们，“在不影响方法学鉴定能力的情况下，调节电渗流来缩短含多个磷酸化位点肽段的迁移时间”这一策略可以提升CZE-MS在磷酸化蛋白质组学分析中的通量。

此外，作者也比较了未被磷酸化肽段以及磷酸化肽段之间的pKa分布差异（如图5所示）。正如作者设想中一样，大多数磷酸化肽段的等电点（pI）均较低。大部分被含钛磁珠富集到的磷酸化肽段是来源于酸性激酶底物。

Figure 4. Migration time distributions: (A) identified peptides; (B) phosphopeptides with two and three phosphorylation sites

 

 

Figure 5. pKa distributions of (A) all of the identified peptides and (B) the phosphopeptides with two and three phosphorylation sites.

 

3.4 磷酸化肽段的富集分析

通过PANTHER系统，对由CZE-MS鉴定到的磷酸化肽段进行GO生物学过程、细胞组分、分子功能、蛋白种类富集分析。如图6A所示，被鉴定到的磷酸化肽段主要参与细胞代谢、调控、生物合成等过程。图6B提示在细胞组分方面，作者也鉴定到了许多与细胞器及细胞膜相关的磷酸化蛋白。图6C和6D说明在分子功能层面，许多磷酸化蛋白质与催化、转运、结合等过程有关。其中，Q99N57激酶也被检测到。

3.5 磷酸化肽段的Motif分析以及与LC-MS的对比结果

作者以小鼠数据库为参考，对CZE-MS和LC-MS所检测到的磷酸化肽段进行了Motif分析。结果表明两种方法均鉴定到了961类蛋白质组，但有其他559类蛋白质组仅被CZE-MS鉴定到，同时也有其他4104种蛋白组仅被LC-MS鉴定到。因此作者认为，CZE-MS可以作为一种补充手段，与LC-MS共同使用，用于更加复杂的磷酸化肽段鉴定中。

Figure 6. Enrichment analysis of identified phosphorylated proteins by CZE−MS: (A) biological process; (B) cellular component; (C) molecular function; (D) protein class

4. 结论

本文将CZE与Orbitrap Fusion Lumos Tribrid质谱仪连用，该系统配备高级的峰提取算法可用于磷酸化蛋白质组分析，实现了对220 ng样本（来源于小鼠脑部的富集磷酸化肽段）中超过4000种磷酸化肽段的鉴定。

CZE-MS可以作为一种补充手段，与LC-MS共同使用，用于更加复杂的磷酸化肽段鉴定中。