1. ########################################
  2. ############### Mapping ################
  3. ########################################
  5. ################
  6. #(1) build index
  7. ################
  8. bwa index -a bwtsw -p <reference> <reference.fa>
  10. ################
  11. #(2) Sort reference
  12. ################
  13. samtools faidx reference.fasta
  15. ################
  16. #(3) Create sequence dictionary
  17. ################
  18. java -jar CreateSequenceDictionary.jar REFERENCE=reference.fa OUTPUT=reference.dict
  20. ################
  21. #(4) Align samples to reference genome with bwa mem
  22. ################
  23. bwa mem -M -t 12 -R '@RG\tID:uniq_ID\tSM:Sample_name\tLB:Sample_name_lib_num\tPL:ILLUMINA' \
  24. reference left.fq right.fq | \
  25. samtools view -bS - > Sample_name_lib_num.bam
  27. ################
  28. #(5) Fix Mate Information
  29. ################
  30. samtools fixmate -O bam Sample_name_lib_num.bam Sample_name_lib_num.fixmate.bam
  32. ################
  33. #(6) Sort BAM file
  34. ################
  35. samtools sort -T /tmp/Sample_name_lib_num.sorted -o Sample_name_lib_num.sorted.bam Sample_name_lib_num.fixmate.bam
  37. ########################################
  38. ############# Improvement ##############
  39. ########################################
  41. ###############
  42. #(7)Splits reads with Ns in CIGAR
  43. ###############
  44. java –jar GenomeAnalysisTK.jar \
  45. –T SplitNCigarReads \
  46. –R reference.fa \
  47. –I Sample_name_lib_num.sorted.bam \
  48. –o Sample_name_lib_num.sorted.SplitNCigar.bam \
  49. –U ALLOW_N_CIGAR_READS \
  50. –rf ReassignOneMappingQuality \
  51. –RMQF 255 \
  52. –RMQT 60
  54. ################
  55. #(8)Identify target regions for realignment
  56. ################
  57. java -Xmx2g -jar GenomeAnalysisTK.jar -T RealignerTargetCreator \
  58. -R reference.fa \
  59. -I Sample_name_lib_num.sorted.SplitNCigar.bam  \
  60. -ip 50 \
  61. -o Sample_name_lib_num.sorted.SplitNCigar.intervals
  63. ################
  64. #(9) Perform realignment
  65. ################
  66. java -Xmx4g -jar GenomeAnalysisTK.jar -T IndelRealigner \
  67. -R reference.fa \
  68. -I Sample_name_lib_num.sorted.SplitNCigar.bam  \
  69. -targetIntervals Sample_name_lib_num.sorted.SplitNCigar.intervals \
  70. -output Sample_name_lib_num.realigned.bam
  72. ################
  73. #(10) fixes mate information that may be changed during the realignment process
  74. ################
  75. java -Djava.io.tmpdir=/tmp/ \
  76. -jar picard.jar FixMateInformation \
  77. INPUT=Sample_name_lib_num.realigned.bam \
  78. OUTPUT=Sample_name_lib_num.realigned.fixed.bam \
  79. SO=coordinate \
  80. VALIDATION_STRINGENCY=LENIENT \
  81. CREATE_INDEX=true
  83. ################
  84. #(11) Build the recalibration model
  85. ################
  86. java -Xmx4g -jar GenomeAnalysisTK.jar -T BaseRecalibrator \
  87. -R reference.fa \
  88. -I Sample_name_lib_num.realigned.fixed.bam \
  89. -ip 50 \
  90. -o Sample_name_lib_num_recalibration.table 
  92. ################
  93. #(12) Apply the recalibration model
  94. ################
  95. java -Xmx4g -jar GenomeAnalysisTK.jar -T PrintReads \
  96. -R reference.fa \
  97. -I Sample_name_lib_num.realigned.bam \
  98. -BQSR Sample_name_lib_num_recalibration.table \
  99. -o Sample_name_lib_num.realigned.recal.bam
  101. ################
  102. #(13) Mark Duplicates
  103. ################
  104. java -jar $PICARD MarkDuplicates \
  105. I=Sample_name_lib_num.realigned.recal.bam \
  106. O=Sample_name_lib_num.improvement.bam \
  107. M=Sample_name_lib_num_dedup_metrics.txt \
  108. CREATE_INDEX=true
  110. ################
  111. #(14) index BAM using samtools
  112. ################
  113. samtools index Sample_name_lib_num.improvement.bam
  115. ########################################
  116. ########## Variant Calling #############
  117. ########################################
  119. ###################
  120. ## (15) Call variants using HaplotypeCaller in GVCF mode.
  121. ###################
  123. java -jar GenomeAnalysisTK.jar \
  124. -T HaplotypeCaller \
  125. -R reference.fa \
  126. -I Sample_name_lib_num.improvement.bam \
  127. -o Sample_name_lib_num.HaplotypeCaller.vcf \
  128. -ERC GVCF
  129. ###################
  130. #(16) Run GenotypeGVCFs in GVCF mode.
  131. ###################
  132. java -jar GenomeAnalysisTK.jar \
  133. -T GenotypeGVCFs \
  134. -R reference.fa \
  135. -V Sample_name_lib_num.HaplotypeCaller.vcf \
  136. -o Sample_name_lib_num.HaplotypeCaller.gg.vcf
  138. ###################
  139. # (17) Call variants with Samtools
  140. ###################
  141. samtools mpileup -C 50 -uf reference.fa Sample_name_lib_num.improvement.bam | \
  142. bcftools view -bvcg - > Sample_name_lib_num.samtools_var.bcf
  143. bcftools view Sample_name_lib_num.samtools_var.bcf | vcfutils.pl varFilter -D 100 > Sample_name_lib_num.samtools_var.vcf
  145. ###################
  146. # (18) Merge two separate callsets
  147. ###################
  148. java -jar GenomeAnalysisTK.jar \
  149. -T CombineVariants \
  150. -R reference.fa \
  151. --variant input1.vcf \
  152. --variant input2.vcf \
  153. -o output.vcf \
  154. -genotypeMergeOptions UNIQUIFY

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