Journal of Proteome Research | An automated ‘cells-to-peptides’ sample preparation workflow for high-throughput, quantitative proteomic assays of microbes (解读人：陈浩）

文献名：An automated ‘cells-to-peptides’ sample preparation workflow for high-throughput, quantitative proteomic assays of microbes（一种基于高通量的，自动的由细胞制备多肽的样品自动处理工作体系的微生物蛋白组定量实验）

期刊名：Journal of Proteome Research

影响因子：3.86

单位：

1. 联合生物能源研究所，劳伦斯伯克利国家实验室，埃默里维尔，加利福尼亚州，美国
2. 敏捷生物基金会，劳伦斯伯克利国家实验室，埃默里维尔，加利福尼亚州，美国
3. 劳伦斯伯克利国家实验室生物系统与工程部，伯克利，加利福尼亚州，美国
4. 圣地亚国家实验室，利弗莫尔，加利福尼亚州，美国
5. 美国加州大学伯克利分校化学系
6. 美国加州大学伯克利分校生物工程系
7. 加州大学化学与生物分子工程系 伯克利，加利福尼亚州，美国
8. 诺和诺德基金会生物可持续性中心，丹麦技术大学，丹麦
9. 中国深圳市先进技术研究院合成生物研究所合成生物化学中心
10. 分子生物物理学和生物成像，劳伦斯伯克利国家实验室，伯克利，加利福尼亚州，美国
11. 西班牙比兹凯亚毕尔巴鄂巴斯克应用数学中心BCAM

主要参与人员：Yan Chen, Joel M. Guenther, Jennifer W. Gin, Leanne Jade G. Chan, Zak

Costello, Tadeusz L. Ogorzalek, Huu M. Tran,Jacquelyn M. Blake-Hedges, Jay

D. Keasling, Paul D. Adams, Héctor García Martín, Nathan J. Hillson, 
and Christopher J. Petzold

一、概述

针对革兰氏阴性细胞（G+）和真菌，本文发展了一种自动且高通量的包含细胞裂解、蛋白质沉淀、蛋白质重悬、总蛋白测定、蛋白质含量归一化、胰蛋白酶酶切等过程的工作体系。为避免去污剂和变性剂的使用，此工作体系使用了C:M（甲醇：氯仿）策略裂解蛋白。这个工作体系可以同时处理384个样品（4个96孔板）。在6.3小时内完成酶解前的步骤。对该工作体系进行测试，结果显示在96个Escherichia coli中可以用MRM的质谱方法定量600个多肽时，均值的变异系数为15.8%

二、研究背景

蛋白质定量试验在临床医学中的应用越来越广泛，质量分析器精度、数据处理速度、数据质量的提升都迫在眉睫，这就要求前期样品制备过程中通量和稳定性也需要极大提升。传统的手工样品制备过程耗时，步骤繁杂，需要进行液体转移的步骤多。

近些年来出现了很多种自动样品制备方案，但是这些方案中使用的FASP细胞裂解法、尿素裂解法耗时，步骤繁杂，容易样品丢失。这些方法中使用的MWCO膜不可以接受和手工样品制备相同的离心速度。因此，我们需要一组省时间，步骤简单，通量高，稳定性好的自动样品制备方法。

三、实验设计

四、研究成果

1.工作体系显示

2.自动工作体系的优化

使用自动样品制备体系和手动样品制备体系对不同OD（0.5，1.0，2.0，3.0）的Ecoli菌液进行蛋白定量，蛋白含量和菌液OD值成线性关系，R²=0.9956 ；计算自动样品制备体系的回收率，发现在OD值为1.0时，回收率最高，表示此时蛋白丢失最少。

3.通过目标蛋白试验测定自动工作体系的可重复性

使用目标蛋白试验方法，对自动工作体系，熟练手动工作体系及不熟练手动体系制备的样品进行蛋白数和多肽数的测定，结果显示自动样品制备过程多肽和蛋白的变异率分别是15.8%，13.8%，和手动有经验的操作相似，远低于手动无经验操作者的变异率。

除了E.coli被证明变异率为15.8%外，还用了P.putida, S.cerevisiae, R.toruloides菌种对此自动样品处理体系进行了验证，整明此体系除了E.coli外，对P.putida, S.cerevisiae, R.toruloides等菌种也适用。

4.在自动工作体系中寻找均值变异率的原因

针对均值变异率的原因，本文分别在是否标准化、采用何种定量方法、使用哪种反应容器方面进行了探究。结果显示采用标准化比不采用标准化变异率更低，TufA是一种均值变异率更低的定量方法，在96孔板上进行的反应，均值变异率更低。

五、讨论

1.本文提出的自动工作体系使细胞到多肽的整个过程，除了蛋白定量和离心，其他的液体转移步骤都可通过高通量，自动的工作站来完成。对比手动样品制备，效率大大提高

2.本文提出的自动样品制备工作体系在裂解细胞获得多肽的过程中没有使用去污剂和变性剂，而是使用的C:M(氯仿：甲醇)配合获得多肽，此方法减少了多肽制备的除盐步骤，节省了时间。

3.本文提出的工作体系不但可以获得大肠杆菌中的多肽，还可以获得真菌细胞里的多肽

4.本文提出的工作体系不但适用于靶向蛋白组策略，也适用于shotgun蛋白组学策略

5.此工作体系未来需要测试是否可用于革兰氏阳性菌的多肽制备

6.此工作体系未来可以往全自动方向发展

解读人：陈浩，华大临床检验中心科技研发联合培养博士，从事单细胞蛋白质组学的研究