解析Illumina+PacBio组装策略

(2016-12-08 13:21:58)

   

基于Illumina和PacBio平台的“二加三”组装策略,巧妙的融合了PacBio平台超长读长、无PCR扩增和Illumina平台成本低等优势,成为目前基因组研究最经济有效的方式。那么问题来了,这个“二加三”策略究竟是如何利用两种平台测序数据的?是以二代数据为主还是以三代数据为主?今天,小编将为您揭晓答案。

方案一:以三代数据为主,通过三代数据进行组装,使用二代数据对三代数据进行纠错。

这是目前大部分已发表的文章使用的组装策略。由于PacBio第三代测序成本稍高但测序数据可轻松跨越复杂基因组区域,而Illumina平台数据稳定可靠,重复性强,数据质量高,成本低,通过此方案结合使用两种平台测序数据,不仅保证了组装结果的准确性,还充分利用了PacBio超长读长的优势,这将十分有利于动植物基因组高GC含量序列及重复序列单元的拼接组装。

案例解析一:大猩猩苏茜基因组组装

第一次大猩猩基因组组装以一只名为Kamilah的雌性西部低地大猩猩,采用短读长和Sanger测序数据组装,发表于2012年的《Nature》杂志。2016年4月发表的苏茜基因组组装文章,采用以PacBio测序为主的“二加三”组装策略,极大的提升了组装效果,让大猩猩又火了一把。

两个版本大猩猩基因组比较

文章发表时间

组装策略

Contig N50

Scaffold N50

2012

Illumina+Sanger

11.8Kb

914Kb

2016

PacBio+Illumina

9.6Mb

23.1Mb

 

 

组装流程

Step 1: PacBio RS II 平台,P6-C4试剂,20Kb文库,74.8x测序深度,组装后的基因组大小为3.1Gb,其中contig N50:9.6Mb,scaffold N50:23.1Mb,大多较短的contigs(<100 Kb)包含着丝粒或端粒卫星序列或折叠的片段重复。其组装连续性相对于最初的大猩猩组装提升819倍,相对于最近的组装结果提升180倍,并且填补了94%的gap;

 

Step2: Illumina HiSeq平台,对苏茜和另外6只大猩猩进行全基因组测序,通过对比进行错误矫正,并进行错误评估,从而减少误差,保证组装的准确率。

大猩猩基因组组装示意图

 

案例解析二:复活草基因组组装

复活草极其耐旱,它具有通过脱水变成完全干燥、同时保持在有水时再复活的能力。核型为2n = 2x = 18,基因组大小约245Mb。获得高度耐旱物种的基因组草图可有效推动作物改良,为植物比较基因组学研究团队提供有价值的资源。

组装流程

Step 1: PacBio RS II 平台,P6-C4试剂盒,15-20Kb文库,32个SMRT cells,72×测序深度,组装获得650 Contigs,Contig N50达到2.4Mb;

Step 2:Illumina HiSeq平台,570bp、1kb、3kb文库,200X测序深度,评估PacBio组装的错误率以及基因组的杂合度;

Step 3:BioNano Irys系统,构建基因组图谱,对Contigs进行anchoring和scaffolding,最终组装完成244Mb,即获得>99.6%的基因组序列信息,Contig N50达到2.4Mb,Scaffold N50达到7.1Mb。

PacBio跨越复活草复杂区域

方案二:以二代数据为主,使用二代数据组装得到Contig,然后使用三代数据进行Scaffolding 和Gapfilling。

由于该方案仍是以短读长来进行基因组组装,所以在组装重复序列单元和复杂区域时,仍然难以实现完美组装。但是该方案使用的三代数据较少,成本会有显著降低。所以该方案适合基因组序列比较简单、科研预算较少的研究者。

案例解析:苹果基因组组装

苹果富含丰富的营养和风味,是世界四大水果之冠,高质量的苹果基因组序列对于分子育种非常关键。作者采用以Illumina测序为主的“二加三”组装策略de novo测序和拼接,组装完成苹果参考基因组序列,并通过基因注释分析发现,该品种基因组中的串联重复序列达382 Mb,覆盖了苹果基因组的60%,所以如果单独使用Illumina数据进行组装,即使是高深度也无法获得满意的组装效果。

技术路线 

组装流程

Step 1:Illumina  HiSeq平台,76 Gb(~102×)全基因组测序数据,组装全长为1.05 Gb,Contig N50 :534 bp,组装效果受到杂合度和重复序列的影响,组装效果较差;

Step 2:PacBio RS,21.7 Gb(~29×),632.4 Mb数据,结合Illumina数据组装后,Contig N50 : 111,619  bp,覆盖率达预估苹果基因组(701 Mb)的90%。由于PacBio平台的使用,其Contig N50相比于之前发表的 16.1 kb提升了约6.9倍。

小结

无论是从组装效果还是发表文章情况来看,以三代为主的“二加三”组装策略具有明显优势。所以在科研经费充足的情况下,小编建议优先选择方案一进行基因组组装,如果您的经费再允许,请加上BioNano测序数据,组装效果和准确度可得到显著提升。

贝瑞和康作为三代测序技术的领导者,同时拥有PacBio Sequel和BioNano平台,并且Sequel v1.2.1试剂已经取得理想的数据产出,敬请关注后续相关报道。如需咨询请联系当地销售,或致电010-84409702/电子邮件sequence@berrygenomics.com。

参考文献

1.Gordon D, Huddleston J, Chaisson MJ, et al. Long-read sequence assembly of the gorilla genome. Science, 2016.

2.VanBuren R, Bryant D, Michael TP, Mockler TC. Single-molecule sequencing of the desiccation-tolerant grass Oropetium thomaeum. Nature. 2015.

3.Xuewei Li, et al. Improved hybrid de novo genome assembly of domesticated apple (Malus x domestica. GigaScience 2016.

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