topGO

前面我们讲过GO.db这个包，现在接着延伸topGO包，该包是用来协助GO富集分析

1）安装

if("topGO" %in% rownames(installed.packages()) == FALSE) {source("http://bioconductor.org/biocLite.R");biocLite("topGO")}
suppressMessages(library(topGO))
ls("package:topGO")

2）使用方法

该包主要有三个使用步骤：

2.1、Data preparation:准备数据集，用于构建 topGOdata.对象。

2.1.1、包括gene标识符(List of genes identifiers)及相应的分值gene scores(例如p值等)
2.1.2、差异表达基因list或经一定标准按照分值筛选的基因集用于后续分析(list of differentially expressed genes or a criteria for selecting genes
        based on their scores)；
2.1.3、identifier和GO term间的map，即GOterm表:（gene-to-GO annotations ） ####例如测试文件中的geneid2go.map
2.1.4、GO的层级结构，由GO.db提供，目前这个包只支持GO.db提供的结构

goterm表示例（gene-to-GO annotations ）：

2.2、Running enrichment tests：进行富集分析，用任何可行的混合统计测试和方法来处理 GO拓扑结构(GO topology)

2.3、Analysis results：用 summary functions 和 visualisation tools对第二步进行统计和可视化

3）简单示例(guide)

3.1.1、准备输入文件

library(ALL)
data(ALL)
data(geneList)   ##文件1：基因list，
affyLib <- paste(annotation(ALL), "db", sep = ".")          #####"hgu95av2.db"
library(package = affyLib, character.only = TRUE)       ########GO term表
sum(topDiffGenes(geneList)     ###选择差异基因集，

3.1.2、构建 topGOdata对象(核心步骤)：

sampleGOdata <- new("topGOdata",
                     description = "Simple session",  ##topGOdata的描述，可选
　　　　　　　　        ontology = "BP",                 ##可指定要分析的GO term的类型，即BP、CC之类
                     allGenes = geneList,             ##基因identifier的原始列表
　　　　　　　　        geneSel = topDiffGenes,          ##geneSelectionFun联合作用，筛选出后续参与分析的基因
                     nodeSize = 10,                   ##富集的GO term辖下基因的最小数目，这里选择10.即最少10个
                     annot = annFUN.db,               ##提取gene-to-GO mappings 的对应关系
　　　　　　　         affyLib = affyLib)
sampleGOdata

3.2 Performing the enrichment tests

有了topGOdata对象，接下来就可以用来进行富集分析。这里用两种检验方法：Fisher’s exact test (基于 gene counts)和Kolmogorov-Smirnov like test (computes enrichment based on gene scores)。
其中用runTest函数来进行这些检验，该函数含有3个参数：第一个是topGOdata对象、第二个是algorithm(用于指定处理 GO graph structured的方法）、第三个是statistic(用于指定检验方法)

resultFisher <- runTest(sampleGOdata, algorithm = "classic", statistic = "fisher")   ##Fisher’s exact test

resultKS <- runTest(sampleGOdata, algorithm = "classic", statistic = "ks")  #Kolmogorov-Smirnov test,classic method
resultKS.elim <- runTest(sampleGOdata, algorithm = "elim", statistic = "ks")#Kolmogorov-Smirnov test, elim method

3.3 Analysis of results

当富集检验结束后，我们就可以分析并解析结果。

runTest()这个函数用来分析显著富集的 GO terms及其相应的p值。

allRes <- GenTable(sampleGOdata,                 ##之前构建的topGOdata实例
　　　　　          classicFisher = resultFisher,  ##生成GO graphde的方法
                  classicKS = resultKS,          ##生成GO graphde的方法
　　　　　          elimKS = resultKS.elim,        ##生成GO graphde的方法
                  orderBy = "elimKS",
　　　　　          ranksOf = "classicFisher",
　　　　　          topNodes = 10)                 ##这里显示前10个显著结果

用 score()函数来测评topGO结果对象中 GO term的 p-values ，并用散点图来说明。

pValue.classic <- score(resultKS)
pValue.elim <- score(resultKS.elim)[names(pValue.classic)]
gstat <- termStat(sampleGOdata, names(pValue.classic))
gSize <- gstat$Annotated / max(gstat$Annotated) * 4
plot(pValue.classic, pValue.elim, xlab = "p-value classic", ylab = "p-value elim",pch = 19, cex = gSize)

差看显著富集的GO terms在 GO graph中的分布.

showSigOfNodes(sampleGOdata, score(resultKS.elim), firstSigNodes = 5, useInfo = 'all')

4)实战

4.1 原始数据集的准备（上面的4个文件）

library(topGO)
library(ALL) ##准备数据集
data(ALL)    ##文件1：原始数据集
BPterms <- ls(GOBPTerm)
MFterms <- ls(GOMFTerm)
CCterms <- ls(GOCCTerm)
head(BPterms)
head(MFterms)
head(CCterms)

library(genefilter)   ##对原始数据进行过滤
selProbes <- genefilter(ALL, filterfun(pOverA(0.20, log2(100)), function(x) (IQR(x) > 0.25)))#数据清洗
eset <- ALL[selProbes, ]   ##数据清洗：这里去掉及其低表达的基因，及探针在每个样品中表达变化不大的的基因

myInterestingGenes <- sample(geneNames, length(geneNames) / 10) #文件二：经一定标准对p值等筛选获取感兴趣基因集用于后续分析
geneList <- factor(as.integer(geneNames %in% myInterestingGenes))
names(geneList) <- geneNames
str(geneList)

geneID2GO <- readMappings(file = system.file("examples/geneid2go.map", package = "topGO"))##文件三：goterm的map文件
str(head(geneID2GO))

GO2geneID <- inverseList(geneID2GO)  ###额外知识：用inverseList()函数实现gene-to-GOs与 GO-to-genes 之间的转换
str(head(GO2geneID))     ##