通过FISH和下一代测序检测肺腺癌ALK基因融合比较

ALK FISH探针是FDA批准的用于检测肺癌患者中ALK重排的方法，这些患者可能受益于ALK激酶抑制剂。FISH测定在技术上可能具有挑战性并且难以解释。已经有研究者提出以ALK免疫组织化学和下一代测序作为替代方法。在本研究中，我们比较了各种ALK-FISH模式与下一代测序（NGS）针对基因融合的检测效果，以及ALK免疫组织化学（IHC）和肿瘤对克唑替尼的反应。在2116例肺腺癌样本中，72例（4％）是ALK-FISH阳性，其中28个ALK-FISH阳性病例用于研究，包括15个分裂信号（54％），10个单个橙色信号（36％），和3个混合信号（10％）。12例（80％）分裂信号和4例（40％）单一橙色信号的病例为NGS和IHC阳性，混合信号病例均为阴性。不一致病例的突变分析显示多个突变，包括EGFR，KRAS，BRAF和ATM基因。在具有分裂信号和混合信号的组中所有不一致病例显示重排细胞数较低（平均28.5％；范围20.5-36.9％）。在对克唑替尼的反应和FISH之间没有观察到统计学显着关联（p=0.73）。相比之下，NGS融合阳性病例对克唑替尼的反应好于NGS阴性病例（p=0.016）。我们的研究表明单独使用ALK FISH可能不是检测ALK基因重排最可靠的方法，可能应与ALK IHC和NGS并行使用检测基因融合和突变。

　　方法

　　2116肺腺癌和具有腺癌组分的NSCLC患者，在2009-2013年在匹兹堡大学医学中心通过FISH测试ALK重排，其中72例显示为阳性，我们从中随机选取28例进行对比研究。

　　免疫组织化学：使用UltraView DAB检测试剂盒在BenchMark XT自动染色机上，使用抗ALK（D5F3）单抗在4μm厚的FFPE切片上进行ALK的免疫组织化学。

　　FISH检测：ALK重排的FISH分析，使用ALK Break Apart FISH试剂盒和LSI ALK 5‘探针和LSI ALK 3’探针，杂交并与标准对照。

　　新一代测序：对于ALK融合的检测，使用基于多重扩增子的靶向NGS测序，可检测169个已知的基因融合，涉及19个靶基因和94个融合伴侣。

　　检测突变和拷贝数变异：使用Ion AmpliSeq TM Cancer Panel测定。

　　结果

　　我们的研究表明在ALK重排状态的评估和解释中遇到困难和挑战。ALK FISH测定目前是评估ALK基因重排的金标准，并且高度预测对克唑替尼的反应。

　　我们的观察表明5‘删除模式表示异质的肿瘤组，比分离信号的情况更容易出现假阳性结果。类似地，混合病例虽然数量有限，但其NGS和IHC检测结果都是阴性的，并且显示较低百分比的ALK阳性细胞。在决定ALK靶向治疗之前，可以在这两组特定病例中考虑其他检测方法，如NGS和IHC。

　　本研究中特别重要的是，NGS可以更可靠地选择最可能响应克唑替尼的靶向治疗的患者。这种情况进一步支持最近发表的观点，肺癌中的致癌突变和基因重排不一定是相互排斥的。此外，我们的研究支持这样的想法，肺癌应同时检测大量的致癌突变，基因重排和可能的基因拷贝数变化，因为基因组异常是复杂的，可能影响肿瘤对靶向治疗的反应。各种NGS平台具有在小肿瘤样品上同时检测许多基因组异常的巨大优势，并且提供对肿瘤突变负担的更好理解，其可以具有很好的预测和预后意义。因此，我们认为，NGS方法应当成为临床实践中肺癌检测的标准方法。

　　结论

　　总之，我们的研究表明ALK FISH可能不是评估肺癌ALK基因重排的最可靠的方法。由于ALK IHC显示出与基因融合的存在高度一致性，因此它应该被认为是ALK FISH的替代方法，并且可能是更具成本效益的初始筛选方法。如果实验室不采用NGS，而是决定并行运行ALK IHC和ALK FISH用于融合基因检测，应该考虑不一致结果的情况。此外，目前的实践建议不需要ALK FISH阳性模式的详细报告，但是基于我们的观察，FISH测定倾向于在具有单个橙色信号和混合信号组中显示高比率的假阳性结果。因此，应该强烈地考虑各种FISH模式的详细定量报告，因为它们可能暗示假阳性结果的存在，并促使病理学家进行额外的IHC或NGS检测。我们的观察应该在更大的一组患者中进行前瞻性验证。

表1 基于NGS的ALK融合检测和FISH检测的总结

表2 NGS ALK融合阴性病例的突变分析

图1 ALK FISH模式和ALK IHC的实例

　　A.ALK FISH融合和分裂信号与B.相应的强ALK IHC染色（放大20倍）；C.ALK FISH单一橙色信号和D.对应的ALK IHC弱染色（放大20倍）E.ALK FISH分裂模式与F.ALK IHC阴性染色（放大20倍）

　　图2 对克唑替尼的响应和A.ALK FISH，B.NGS ALK融合检测

　　信息来源：

　　Sanja Dacic, Liza C. Villaruz, Shira Abberbock, et.al. ALK FISH patterns and the detection of ALK fusions by next generation sequencing in lung adenocarcinoma. Oncotarget, Advance Publications 2016.