MIT molecular Biology 笔记10 翻译

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教材 Molecular biology of the gene 7th edition  J.D. Watson et. al

翻译

　　翻译机器的组成

• mRNA
• tRNA
• aminoacyl tRNA synthetase
• ribosome

一、信使RNA

1、多肽链是由可读框决定的

• 含有多个ORF的mRNA叫多顺反子
• 只有1个ORF的mRNA叫单顺反子

2、原核细胞mRNA具有核糖体结合位点，可以募集翻译机器

• 核糖体结合位点（RBS）
• 一般位于

  密码子5'端 3~9bp内

• 与核糖体 16S rRNA 的 3'端互补（5' CCUCCU 3'）
• 某些原核细胞ORF缺乏RBS也能翻译，是因为ORF紧接着上一个ORF：翻译耦合translational coupling

3、真核细胞mRNA在5' 和 3' 被修饰，促进翻译

• 真核mRNA的 5'帽是甲基化鸟嘌呤核苷酸
• 可以募集核糖体结合
• 核糖体向下游扫描，寻找AUG

• 在某些mRNA中，起始密码子周围有些保守位点
  
• 5'- G/ANNAUGG-3' Kozak序列：与起始tRNA互作
• 3' poly-A 尾： 增强5'Cap 的募集作用
• 帽和尾 稳定RNA

二、转运RNA

1、tRNA是密码子与氨基酸之间的转配器

　　特征

• 3'端均为5'-CCA-3' ：氨基酸结合位点
• 存在特殊碱基：
  
• ΨU 假尿嘧啶
• D 双氢尿嘧啶
• H 次黄嘌呤
• T胸腺嘧啶
• Gm 甲基鸟嘌呤

2、共有三叶草二级结构

• 受体臂
• ΨU loop
• D loop
• anticodon loop
• variable loop

3、tRNA具有L形三维结构

三、氨基酸连接到tRNA上

1、氨基酸通过高能酰基连接到tRNA 3'端腺苷酸上使tRNA负载

• 腺苷酰基化 adenylylation（ATP）
• tRNA负载

2、每种氨酰-tRNA合成酶连接一种氨基酸到一种或多种tRNA上

　　每个氨基酸对应一种合成酶

• 特殊的合成方式：Glu合成到tRNA^Gln，Glu在氧化成Gln

3、tRNA合成酶识别位于同族（cognate）tRNA上独特结构特征

• 受体臂上鉴别者碱基
• 反密码子环

4、保证氨酰-tRNA合成的精确

• 酶口袋的尺寸阻止大氨基酸进入
• 酶中的编辑口袋水解尺寸过小的氨基酸
• 那么只有正确的氨基酸能合成

5、核糖体不能辨别tRNA的负载是否正确

6、硒代半胱氨酸

• 存在于谷胱甘肽过氧化物酶，甲酸盐脱氢酶
• 由UGA终止密码合成：特殊地机制

四、核糖体

• DNA复制速度 200~100bp/s
• 转录速度 50~100bp/s
• 翻译 原核 20AA/s   真核 2~4AA/s

1、核糖体由一个大亚基，一个小亚基组成

• 大亚基：肽基转移酶中心 peptidyl transferase center
• 小亚基：解码中心 decoding center
• 大小亚基按照沉降速录命名（不和质量成严格正比）

2、核糖体循环

• 合成方向 N->C
• 形成肽键的过程：将正在延伸的多肽转移到另一个tRNA上
• 肽键的形成不需NTP水解：氨酰-tRNA储存着能量

3、核糖体RNA是核糖体中结构和催化功能决定因子

• 以RNA为中心

4、核糖体有3个tRNA结合位点

• A 氨酰tRNA结合
• P 肽酰tRNA结合
• E tRNA离开位点

5、核糖体内的通道使mRNA与延伸多肽进出

五、翻译的起始

• 核糖体募集
• 负载tRNA置于核糖体P位点
• 核糖体精确定位

1、原核细胞

• 三种起始因子指导 mRNA 和 tRNA 装配起始复合物
• IF1 结合到A位点，防止起始tRNA结合
• IF2 GTP酶，促进起始fMet-tRNA_i^fMet结合至P位点，阻止别的结合
• IF3 与小亚基结合，阻止翻译起始前大亚基结合（最后结合）
• 随着起始因子的加入，小亚基准备好和mRNA，tRNA以任意顺序结合
• 与mRNA结合：RBS 与 16S RNA相互作用
• 结合后，起始密码子正好处于P位点
• 起始 fMet-tRNA_i^fMet 的结合：通过GTP与IF2相互作用
• 起始的Met被加上甲酰基（Met-tRNA转甲酰酶） ：f-N -> C
• 起始密码子与起始tRNA配对：小亚基构象变化，IF3释放
• 大亚基结合（IF2作为初始对接位点），形成70S 起始复合体
• IF2、IF1 释放
• 许多蛋白质不是以Met开始的，氨肽酶通常会在氨基酸切除Met及另外一两个氨基酸

2、真核细胞

• 真核细胞中tRNA结合先于mRNA的结合
• 使用另一组辅助因子
• 核糖体小亚基结合上mRNA 的 5'Cap，扫描AUG（ATP)
• 扫描到AUG后，组装大亚基，开始翻译
• 翻译起始因子使真核mRNA保持环状：提高翻译效率

六、翻译的延伸

• 氨酰-tRNA结合上A位点：EF-Tu-GTP辅助
• 延伸：肽酰转移酶将多肽链加到A位点负载tRNA上
• 易位
• 在两种延伸因子的辅助下，正确的阅读ORF

氨酰tRNA结合

1、氨酰-tRNA由延伸因子EF-Tu送达A位点

• EF-Tu-GTP覆盖tRNA3'端的氨基酸：防止过早反应
• 正确匹配结合上A位点后，大亚基的某结构域激活GTP水解
• EF-Tu-GDP释放

2、核糖体利用多种机制排斥错误配对的 氨酰-tRNA

• 小亚基 16S RNA的两个碱基识别 tRNA-mRNA 之间的小沟：错配小沟形状不符合
• EF-Tu-GTP=tRNA复合物要处于正确位点，才能导致GTP水解
• 易位时，错误配对的tRNA容易脱落

肽键的形成

3、核糖体是一种核酶

• rRNA处于活性中心，蛋白起辅助作用
  • 熵催化 entropic catalysis
  • rRNA通过碱基配对，将底物稳定在活性中心已促进反应
• 底物辅助催化
• P 位点 tRNA 的 2'OH 通过质子穿梭机制辅助催化

易位

4、肽键的形成启动大亚基中的易位反应

• 大亚基的易位先于小亚基

5、EF-G推动易位

• EF-G-GTP结合在大亚基上
• EF-G-GTP水解形成EF-G-GDP 构象改变，占据A位点
• 推动小亚基中的易位
• 多米诺骨牌似的使得P位的tRNA易位向E
• 稀有移码tRNA（4bp）补偿移码错误

　　EF-G-GTP 的 分子拟态：

• EF-G-GTP 的形态很像 EF-Tu-GTP=tRNA复合物

6、EF-Tu-GDP 和 EF-G-GDP 在新一轮延伸前，要将GDP换成GTP

• EF-Ts促进 GDP与 EF-Tu解离
• EF-G 与 GDP亲和力<GTP亲和力，直接换

　　

7、形成肽键的一个循环消耗两个GTP，一个ATP

• 氨酰-tRNA的形成 1ATP
• EF-G-GTP 牵引氨酰tRNA正确匹配 1GTP
• EF-G-GDP推动易位 1GTP

翻译的延伸中，原核与真核很相似

EF-Tu ：eEF1

EF-G  ：eEF2

七、翻译的终止

1、释放因子在终止密码子的作用下终止翻译

• 核糖体循环在 终止密码子进入 A 位点后，就停止
• 终止密码子被释放因子识别 release factor
• 两类释放因子
• I 类释放因子识别终止密码子：RF1 、RF2
• II 类释放因子：释放肽链后，刺激 I 类因子从核糖体解离

2、I 类因子的一小段区域识别终止密码子，并催化多肽链的释放

• I 类释放因子上的肽反密码子识别终止密码子
• I 类释放因子的GGQ序列促进了多肽链的释放
• I 类释放因子功能上模仿了tRNA

3、II 类释放因子的功能受GTP、GDP调控

4、核糖体循环因子模仿tRNA

• 核糖体循环因子（RRF）识别结合A位点
• EF-G-GTP结合核糖体，GTP水解，占据A位点，促使RRF易位至P
• 两个tRNA脱落
• IF3 加入 EF-G-GDP脱落

八、翻译的调控

• 翻译主要在起始阶段调控

1、蛋白质或RNA在RBS附近结合负调控细菌翻译的起始

• RNA分子的配对会被核糖体打破，后续的核糖体可以识别

2、原核翻译调控：核糖体蛋白是其自身结合翻译的抑制因子

• 原核核糖体蛋白基因的协同调控通过若干操纵子得以简化
• 核糖体蛋白翻译的自我抑制：
  • rRNA充足时，核糖体蛋白首先结合rRNA
  • rRNA缺乏，核糖体蛋白结合自己的mRNA RBS附近
  • 阻止翻译
  • 

3、真核翻译总体调节因子以mRNA识别及起始tRNA结合所需关键因子作为靶标

• mTor因子对4E-BP的磷酸化与翻译的调控
• 磷酸化的4E-BP不能结合5'Cap，翻译进行
• 这是化疗药物的靶点 雷帕霉素

4、对mRNA特异的4E-BP进行翻译空间的调控

• 果蝇卵母细胞护送Oskar mRNA从前向后运输

5、铁离子调控转铁蛋白翻译

6、酵母转录激活因子Gcn4 的翻译受到上游短ORF及三元复合物丰度的调控

• Gcn基因上游4个小的可读框
• 翻译完第一个可读框的核糖体剩下一个小亚基在mRNA上
• 氨基酸充足，因素介导，小亚基迅速结合三元复合物，寻找下一个ORF起始密码
• 氨基酸缺乏时，小亚基结合三元复合物变慢，小亚基移出小ORF区后，才结合上，识别下游Gcn4基因起始密码，翻译

多聚核糖体谱

• 被核糖体结合多的就是翻译活跃的

九、依赖翻译的mRNA和蛋白质稳定性调节

• mRNA会出错，但在翻译中被识别出来之前，它是稳定的

1、原核生物

• 缺乏终止密码子
• 核糖体在3'末端停滞，A位空缺
• SsrA RNA 加入A位点
• 类似正常的转肽和易位反应，将前面的tRNA和mRNA踢出
• SsrA RNA加入后翻译出来的多肽带有10个氨基酸的标签，招募蛋白将其降解

2、真核生物

① 无意义密码子介导的mRNA衰减

• 真核生物mRNA经过剪接后，会留有 外显子拼接复合物
• 正常的翻译，核糖体会将一路上的 拼接复合物清除
• 如果提前终止了，就有 拼接复合物无法清除
• 招募5'->3'、3'->5'外切酶清除mRNA

② 无终止密码子介导衰减

• 真核mRNA以poly-A结尾
• 无终止密码子，会翻译出尾端的多个 AAA（赖氨酸）
• 招募降解mRNA 和 蛋白质

③ 末端终止介导的衰减 no-go decay

• 当核糖体因为二级结构，或者相关tRNA不够用时，停滞，招募降解

十、遗传密码

1、遗传密码的简并性

• 密码子第一位改动改变氨基酸
• 第二位：嘧啶往往疏水；嘌呤往往极性
• 第三位：较少会发生氨基酸的改变

2、遗传密码的摆动性

反密码子	密码子
G	U 、C
C	G
A	U
U	A、G
I	A、U、C

3、遗传密码遵循3条规律

• 5'->3' 阅读
• 密码子不重叠，信息间不重叠
• 固定可读框上翻译

4、突变与抑制突变

• 错义突变
• 终止突变
• 移码突变

• 一个碱基缺失导致移码突变：可以由随后增加一个碱基的突变补偿
• 因为突变产生的提早的终止子可以被特殊的tRNA抢先读取，

5、遗传密码几乎通用