链终止法|边合成边测序|Bowtie|TopHat|Cufflinks|RPKM|FASTX-Toolkit|fastaQC|基因芯片|桥式扩增|

生物信息学

Sanger采用链终止法进行测序

带有荧光基团的ddXTP+其他四种普通的脱氧核苷酸放入同一个培养皿中，例如带有荧光基团的ddATP+普通的脱氧核苷酸A、T、C、G放入同一个培养皿，以此类推，存在4种不同类型碱基的识别机制，同时，该ddXTP一旦结合在互补链上则会迫使复制停止。

高通量测序是二代测序，先建库后测序：

建库方法：

单末端测序：将DNA双链打碎并接上接头序列，通过改变条件使双链变单链，将待测的单链固定在flowcell上，再加入游离的脱氧核苷酸，采用边合成边测序方法比配并测得互补链，最后冲走互补链。

双末端测序：将DNA双链打碎并接上接头序列，通过改变条件使双链变单链，将待测的单链固定在flowcell上，采用桥式扩增（即将模板链和互补链单链都成簇，用酶切，就只剩下模板链和两端引物），通过桥式扩增加强信号。

它的碱基识别是在链终止法的基础上，采用边合成边测序方法：

带有荧光基团的ddXTP+其他三种普通的脱氧核苷酸放入同一个培养皿中，例如带有荧光基团的ddATP+普通的脱氧核苷酸T、C、G放入同一个培养皿，以此类推，存在4种不同类型碱基的识别机制，同时，该ddXTP一旦结合在互补链上则会迫使复制停止。 模板链通过碱基互补配对原则得到互补链，该互补链停止于需识别碱基上，通过测试最后一位碱基所携带的荧光基团，从而确定模板链对应的碱基种类。在确认了该位置的碱基种类之后，会加羟基去去除荧光基团，并使得链又不断复制下去，通过识别后的照片来得到最终的序列组成。

高通量测序的特点是数据量大。

Fasta：

>序列名字

序列本身

Fastq：

@序列信息

序列本身

@序列信息

序列质量：由碱基错误率算得，每个碱基对应一个质量，将具体数值用ASCII表示出来

质量指标：Q20、Q30、Q40

基因芯片和高通量测序的比较：

基因芯片原理：

通过探针捕获游离的带有荧光基团的脱氧核苷酸，然后使其荧光标记发出荧光，辨别荧光强度确定碱基种类并加入羟基使其不再发光，再以此类推确定另外一种荧光种类。

二代测序：双末端测序；边合成边测序

区别：前期样本制备

基因表达：相当

数据分析流程：

图片数据（识别荧光基团测序）----序列信息（fastq）------质控-----assembly----analysis----annotation

Raw data------质控fastaQC------去adoptor/linker(引物)------使用barcode排序------FASTX-Toolkit质控（某特殊位置之后的；低于平均值的）

fastaQC：FASTQC checks whether a set of sequence reads in a .fastq fifile exhibit any unusual qualities.

FASTX-Toolkit：In this section of the tutorial we will be using FASTX-Toolkit (http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/) to fifilter and trim sequences based on quality.

调研（低深度测序）主要用于找到合理建库方法----框架（高深度测序）----精细测序，进行修补

应用：

个体重测序----精准医疗----突变

重测序数据分析：GATK：人群队列测----发现SNP并汇总----发现群体高发SNP

转录组测序：

1.Small RNA seq表达

2.RNA seq表达-:--->Bowtie（短片段RNA比genome）---->Tophat（找到splice junction）----->cufflinks（找到可变剪接）

Bowtie is an ultrafast, memory-efficient short read aligner geared toward quickly aligning large sets of short DNA sequences (reads) to large genomes.

TopHat is a fast splice junction mapper for RNA-Seq reads.

Cufflinks assembles transcripts, estimates their abundances, and tests for differential expression and regulation in RNA-Seq samples.

RPKM (Reads Per Kilobase of transcript per Million mapped reads)

Total Exon reads：比到某个sample上的read数；

total mapped reads：比到某个sample上某gene exon的reads数

exon length：某gene exon长度

所以，

sample之间同一gene比较的是（gene mapped reads数/sample mapped reads数）

同一sample 的不同gene之间比较的是（gene mapped reads数/gene oxen length）

Chip-seq：发现转录因子的结合位点