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教材 Molecular biology of the gene 7th edition  J.D. Watson et. al

DNA复制相关实验

一、

1、聚合酶活力测定 掺入法

膜结合法

  1)DNA聚合酶以标记的dNTP为底物反应

  2)分离dNTP

  • 硝酸纤维素滤膜(带正电)
  • 点样
  • 缓冲溶液洗脱dNTP
    • 50mmol·L-1 NaCl (离子交换的原理?)
    • (2-3molL-1 才能洗DNA)
  • 看DNA上有没有标记核苷酸掺入

  缺点:不能定量,可以看看提取液有没有聚合酶

电泳分离法

  • 变性胶
    • 琼脂糖agarose  + NaOH
    • 聚丙烯酰胺 + 尿素
  • 辅以加热让DNA变性
  • 只标记引物
    • 引物延长实验
    • 避免每个核苷酸被标记

2、聚合酶持续合成能力测定

模板竞争分析

  • 实验分两组
  • 制备两种引物模板接头(PTJ),一种标记,一种不标记
  • 每组加入两倍聚合酶
  • 加入没标记dNTP + 1000x 没标记PTJ
  • 足够时间反应

  聚合酶从标记PTJ掉落后,很难再结合上标记的PTJ,因为没标记的PTJ有1000倍之多

  电泳分析标记的合成产物的长度,即可得知酶的持续合成能力

  

3、解旋酶的测定

assay for helicase

  • 本胶应非变性胶
  • 如想看到所有DNA 溴乙锭染色
  • 为何低盐助变性:高盐高电解质强度,掩盖了DNA双链负电。低盐,负电互斥

assay for helices polarity

用限制酶切段双链部分

4、拓扑异构酶的测定

assay for topoisomerase

supercoil 泳动速度快

区分 type1 type2:

    • kDNA 连环索烃:短膜虫质粒
    • 看relex的速度 1慢 2快

5、核小体定位实验

Assay: 定位核小体实验

  微球菌核酸酶MNase :双链内切酶,非序列特异

      

连接dna的长度会有物种差异,但是盘绕核小体的长度都是一样的

Assay: MNase-seq 可以知道位置

1.深度消化 只剩147bp

2.电泳纯化

3.两端深度测序  ??

4.沿染色体定位

细胞周期任何时机都可以做此实验

通过核小体的限制,让复制、转录蛋白结合在正确位置

二、

1、错配修复分析

  根据限制酶切割位点专一性

2、甲基化的检测

  如下几种酶对不同甲基化程度位点的切割效率不同

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