16S 基础知识、分析工具和分析流程详解

工作中有个真理：如果你连自己所做的工作的来龙去脉都讲不清楚，那你是绝对不可能把这份工作做好的。

这适用于任何行业。如果你支支吾吾，讲不清楚，那么说难听点，你在混日子，没有静下心来工作。

检验标准：随时向别人解释你的工作，让别人提出尖锐的问题，看你是不是答不上来。

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16S概念

• 什么是16S？S是什么意思？
• 16S分析是用来干嘛的？能分析什么？
• 16S大致的分析原理是什么？

有点生物学基础的会知道16S和核糖体有关，但大多数还是搞不清楚它们之间的关系。

先明确一些概念：

核糖体：Ribosome，由 RNA(rRNA）和蛋白质 组成，配合 tRNA 来翻译 mRNA。核糖体按沉降系数来分类，S就是沉降系数，原核70S，真核80S。我们一般研究微生物，70S，由50S和30S两个亚基组成。再细分为 5S、16S、23S，我们的 16S 就是指核糖体的亚基的一个组分，16S rRNA。（记住，这是原核生物核糖体的一个组分）

16S rRNA：这并不是我们的研究对象，因为我们测序的不是它，而是它对应在DNA双链上的基因序列，

16S rDNA。可以这样理解，我们所说的16S 就是指 16S rDNA。

分子钟：即氨基酸在单位时间以同样的速度进行置换。16S 的进化具有良好的时钟性质，在结构与功能上具有高度的保守性，在大多数原核生物中rDNA都具有多个拷贝，5S、16S、23S rDNA的拷贝数相同。16S rDNA由于大小适中，约1.5Kb左右，既能体现不同菌属之间的差异，又能利用测序技术较容易地得到其序列，故被细菌学家和分类学家接受。（来源百度）

所以，16S测序的大致逻辑就是：

拿到一个样品，我们捕获其16S区域（引物PCR），然后测序，16S既然有极好的保守性，那就可以用于鉴别不同的物种（相当于一个物种的独一无二的条形码）（有很大一部分是鉴定不到物种的）。

分析逻辑就是聚类成OTU，然后注释（比对已知数据库），后续分析。

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偶然看到一篇好的科普文，转载一下：来自伯豪生物

1、16S

通常所说的16S是指16S rDNA（或16S rRNA），16S rRNA 基因是编码原核生物核糖体小亚基的基因，长度约1542bp，包括9个可变区和10个保守区，保守区序列反映了物种间的亲缘关系，而可变区序列则能反映物种间的差异。

因16S rDNA分子大小适中，突变率小，故成为细菌系统发育和分类鉴定最常用的标签。

16S测序是指选择16S rDNA某个或某几个变异区域，选择通用引物对环境样本（肠道、土壤、水体等）微生物进行PCR扩增，然后对PCR产物进行高通量测序，并将得到的测序数据与已有的16S rDNA数据库进行比对分析，从而对环境群落多样性进行研究，核心是物种分析，包括微生物的种类，不同种类间的相对丰度，不同分组间的物种差异以及系统进化等。

16S rDNA序列结构

2、OTU

OTU即Operational Taxonomic Units的缩写（千万表手滑写成OUT，否则就OUT了），在系统发生学或群体遗传学研究中，为了便于进行分析，人为给某一个分类单元（品系，属，种、分组等）设置的同一标志。理论上一个OTU代表一个微生物物种。

通过测序获得的大量reads，如何才能转变为我们需要的物种信息呢？首先需要对这些reads进行归类（cluster），通常在97%的相似水平划分为不同的OTU，将OTU代表序列与相应的微生物数据库比对（Silva、RDP、Greengene等），得到每个样本所含的物种信息，进而进行后续生物信息统计分析。

3、Q值

Q值评估用来测序的碱基质量，Q值与测序错误E值之间关系为如果一个碱基的Q值为20，那表示这个碱基的可能测错的可能性为1%。实际操作中常用Q20/Q30作为标准，Q20大于90%妥妥的。

4、Coverage

Coverage值是指各样本文库的覆盖率，数值越高，则样本中序列被检测出来的概率越高，该数值可反映本次测序结果是否代表样本的真实情况。数值越接近于100%，代表本次测序结果越符合样本中微生物的实际情况。

5、Alpha-diversity

Alpha多样性用于度量群落生态单样本的物种多样性，是反映丰富度和均匀度的综合指标。

菌群丰富度（Community richness）指数有：Chao、Ace，Chao或Ace指数越大，说明菌群丰富度越高。  

菌群多样性（Community diversity）指数有：Shannon、Simpson，Shannon值越大，说明群落多样性越高；Simpson指数值越大，说明菌群多样性越低。

根据各样本生成的OTU，对样本序列进行随机取样，以取出的序列数及这些序列所能代表的OTU数构建曲线，计算样本的Alpha多样性。

通常Alpha多样性指数均以表格形式呈现，这显然不利于论文颜值的提升，那么可以将Alpha多样性指数结合起来，出个箱线图（Box-plot）或可有所帮助。

6、Beta-diversity

Beta多样性用于不同生态系统之间多样性的比较，利用各样本序列间的进化关系及丰度信息来计算样本间距离，反映样本（组）间是否具有显著的微生物群落差异。目前应用比较多的是PCA、PCoA、NMDS分析等。由于微生物多样性研究通常会涉及到大样本数量的样本，因此通过Beta-diversity分析可以直观地反映样本组间的差异情况。距离越远，微生物群落差异越大，即相似性越高。

7、LEfSe

LEfSe分析即LDA Effect Size分析，多用于多个分组（≧2）之间的比较，或者进行亚组比较分析，进而找到组间在丰度上有显著差异的物种（biomaker）。

基本过程是首先在多组样本中采用非参数因子Kruskal-Wallis秩和检验检测不同分组间丰度差异显著的物种；然后基于获得的显著差异物种，利用成组的Wilcoxon秩和检验进行组间差异分析；最后采用线性判别分析（LDA）对数据进行降维并评估差异显著的物种的影响力大小（即LDA score）。

LEfSe分析包含了不同分类学水平（门到属或者种）的物种信息，并且是显著差异的物种，因而是一项信息量大、采用率（biger）高的分析，值得拥有~~~

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16S分析流程

建库测序暂且跳过，一下是我们拿到测序数据后的分析步骤：

1. 过滤Filter
2. 连接Connect Tags
3. 聚类OTU Cluster
4. 分类Taxonomy
5. 多样性Alpha_Beta
6. 。。。

Hiseq 的 16S分析流程已经比较成熟了，网上能搜到一些pipeline。

PacBio的 16S分析是最近才开发出来的。

参考文章：High-resolution phylogenetic microbial community profiling

以下是该文章的分析流程：

可以看到，PacBio 16S中大部分都在使用 mothur，这真是个好工具啊，还有详细的教程。

Mothur manual

还有详细的数据库： Alignment database（greengenes 和 SILVA）

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16S分析细节

• step01.OTU_Cluster.sh
• step02.OTU_Taxonomy.sh
• step03.Alpha_Diversity.sh
• step04.OTU_Analysis.sh

以下一次详解：

step01.OTU_Cluster.sh 的核心就是聚类得到 OTU，使用的是mothur，步骤很多。

得到OTU后，将原来的序列比对回得到的OTU上。

usearch7.0.1090/usearch7.0.1090_i86linux32 -usearch_global ./1.Clean_Tags/All_Sample.fasta -db ./2.OTU_Cluster/OTU.fasta -strand both -id 0.97 -uc ./2.OTU_Cluster/global.map.uc

usearch_global command

转化格式

bin/usearch7.0.1090/uc2otutab.py ./2.OTU_Cluster/global.map.uc > ./2.OTU_Cluster/OTU_shared_all.xls

待续~

参考：

16Sr DNA 百科

16s rRNA分析流程和工具的介绍

附录：

稀释性曲线(rarefaction curve)

稀释性曲线(rarefaction curve)：一般是从样本中随机抽取一定数量的个体，统计出这些个体所代表物种数目，并以个体数与物种数来构建曲线。它可以用来比较测序数量不同的样本物种的丰富度，也可以用来说明样本的取样大小是否合理。分析采用对优化序列进行随机抽样的方法，以抽到的序列数与它们所能代表OTU的数目构建rarefaction curve。稀释性曲线图中，当曲线趋向平坦时，说明取样的数量合理，更多的取样只会产生少量新的OTU，反之则表明继续取样还可能产生较多新的OTU。因此，通过作稀释性曲线，可以得出样品的取样深度情况。 默认是在 97%相似性水平下划分OUT并制作各样品的稀疏曲线。

画OTU Rank curve

data <- read.table("Sample.OTU_rank_percent.xls",header=T,check.names=F)
data <- t(data)
data <- data[rowSums(is.na(data)) != 16,]
library("RColorBrewer")
col=c("#00FF40FF","#FF0000FF","#00FFFFFF")
x_point=as.numeric(rownames(data))
x=max(x_point,na.rm=T)
x=x*1.1
y=max(data[,1:ncol(data)],na.rm=T)

pdf("Sample.OTU_rank.pdf",width=6+1*1,height=6)
par(mai=c(1,1,0.5,1*1))
par("usr")
plot(x,y,xlim=c(0,x),ylim=c(0.0005,100),type="n",xlab="Number of OTUs",ylab="Relative abundance(%)",main="OTU Rank Curve",tcl=-0.2,mgp=c(3,0.3,0),cex.lab=1.2,las=1,log="y",yaxt="n")
axis(2,tcl=-0.2,at=c(0.001,0.01,0.1,1,10,100),labels=c(0.001,0.01,0.1,1,10,100),las=1,hadj=0.6)

points(x_point,data[,1],lwd=2,lty=1,cex=0.6,col=col[1],type="l") #C1
points(x_point,data[,2],lwd=2,lty=1,cex=0.6,col=col[2],type="l") #C3.1
points(x_point,data[,3],lwd=2,lty=1,cex=0.6,col=col[3],type="l") #C3.2

legend(par("usr")[2],10^par("usr")[4],legend=colnames(data),col=col[1:3],pch=15,pt.cex=1.2,cex=0.9,bty="n",ncol=1,xpd=TRUE)
dev.off()

png("Sample.OTU_rank.png",type="cairo",width=6+1*1,height=6,units="in",res=120)
par(mai=c(1,1,0.5,1*1))
plot(x,y,xlim=c(0,x),ylim=c(0.0005,100),type="n",xlab="Number of OTUs",ylab="Relative abundance(%)",main="OTU Rank Curve",tcl=-0.2,mgp=c(3,0.3,0),cex.lab=1.2,las=1,log="y",yaxt="n")
axis(2,tcl=-0.2,at=c(0.001,0.01,0.1,1,10,100),labels=c(0.001,0.01,0.1,1,10,100),las=1,hadj=0.6)

points(x_point,data[,1],lwd=2,lty=1,cex=0.6,col=col[1],type="l") #C1
points(x_point,data[,2],lwd=2,lty=1,cex=0.6,col=col[2],type="l") #C3.1
points(x_point,data[,3],lwd=2,lty=1,cex=0.6,col=col[3],type="l") #C3.2

legend(par("usr")[2],10^par("usr")[4],legend=colnames(data),col=col[1:16],pch=15,pt.cex=1.2,cex=0.9,bty="n",ncol=1,xpd=TRUE)
dev.off()