QIIME2使用方法

激活qiime2的执行环境：source activate qiime2-2019.4
如何查看conda已有的环境：conda info -e

以下分析流程参考：https://docs.qiime2.org/2019.4/tutorials/qiime2-for-experienced-microbiome-researchers/ 

1、数据准备

现在我们常用的就是这种格式的数据，每个样品一对数据文件

数据来源：https://docs.qiime2.org/2019.7/tutorials/importing/

wget \
  -O "casava-18-paired-end-demultiplexed.zip" \
  "https://data.qiime2.org/2019.4/tutorials/importing/casava-18-paired-end-demultiplexed.zip"

下载解压后，文件夹中文件如下：

2、将数据转换为qza格式（qiime新定义的自己的格式类型，有点编程中对象的含义）

qiime tools import \
  --type 'SampleData[PairedEndSequencesWithQuality]' \
  --input-path casava-18-paired-end-demultiplexed \
  --input-format CasavaOneEightSingleLanePerSampleDirFmt \
  --output-path demux-paired-end.qza

3、查看数据质量
qiime demux summarize --i-data demux-paired-end.qza --o-visualization demux-summary-1.qzv
用以下命令查看结果：
qiime tools view demux-summary-1.qzv

4、双端序列合并成单端

qiime vsearch join-pairs --i-demultiplexed-seqs demux-paired-end.qza --o-joined-sequences demux-joinded.qza

5、查看对merge后的数据质量情况

qiime demux summarize --i-data demux-joinded.qza --o-visualization demux-summary-merged.qzv

qiime tools view demux-summary-merged.qzv

##### 以下是使用dada2进行数据去噪，本教程先跳过该步，之后有专门教程介绍dada2使用

4、对数据进行剪切

双端：
qiime dada2 denoise-paired \
  --i-demultiplexed-seqs demux-paired-end.qza \
  --p-trim-left-f 13 \
  --p-trim-left-r 13 \
  --p-trunc-len-f 150 \
  --p-trunc-len-r 150 \
  --o-table table.qza \
  --o-representative-sequences rep-seqs.qza \
  --o-denoising-stats denoising-stats.qza

单端：

qiime dada2 denoise-single \
  --i-demultiplexed-seqs demux-joinded.qza \  #输入应该也是序列，不能是joined对象
  --p-trim-left 13 \
  --p-trunc-len 150 \
  --o-table table.qza \
  --o-representative-sequences rep-seqs-merged.qza \
  --o-denoising-stats denoising-stats-merged.qza

https://forum.qiime2.org/t/demultiplexing-and-trimming-adapters-from-reads-with-q2-cutadapt/2313

以下参考：

https://blog.csdn.net/woodcorpse/article/details/86685524

https://mp.weixin.qq.com/s/6cLzyJjWQmHm82_U6euJ1g

5、序列质控

qiime quality-filter q-score-joined \
--i-demux demux-joinded.qza \
--o-filtered-sequences demux-joined-filtered.qza \
--o-filter-stats demux-joined-filter-stats.qza

输出结果:

• demux-joined-filter-stats.qza: 统计结果
• demux-joined-filtered.qza: 数据过滤后结果

6、用deblur去冗余，并生成特征表（相当于QIIME1的OTU Table）

qiime deblur denoise-16S \
--i-demultiplexed-seqs demux-joined-filtered.qza \
--p-trim-length 250 \
--p-sample-stats \
--o-representative-sequences rep-seqs.qza \
--o-table table.qza \
--o-stats deblur-stats.qza

输出结果:

• rep-seqs.qza: 代表序列
• deblur-stats.qza: 统计过程
• table.qza: 特征表

备注：

由于DADA2和Deblur产生的“OTU”是通过对唯一序列进行分组而创建的，因此这些OTU相当于来自QIIME 1的100%相似度的OTU，通常称为序列变体。在QIIME 2中，这些OTU比QIIME 1默认的97%相似度聚类的OTU具有更高的分辨率，并且它们具有更高的质量，因为这些质量控制步骤比QIIME 1中实现更好。因此，与QIIME 1相比，可以对样本的多样性和分类组成进行更准确的估计。

7、查看deblur去冗余后的特征表

qiime feature-table summarize \
  --i-table table.qza \
  --o-visualization table.qzv
  --m-sample-metadata-file sample-metadata.tsv

qiime feature-table tabulate-seqs \
  --i-data rep-seqs.qza \
  --o-visualization rep-seqs.qzv

qiime tools view table.qzv

8、统计每个样品包含的序列数

qiime deblur visualize-stats \
  --i-deblur-stats deblur-stats.qza \
  --o-visualization deblur-stats.qzv

qiime tools view deblur-stats.qzv

9、构建进化树用于多样性分析

qiime phylogeny align-to-tree-mafft-fasttree \
  --i-sequences rep-seqs.qza \
  --o-alignment aligned-rep-seqs.qza \
  --o-masked-alignment masked-aligned-rep-seqs.qza \
  --o-tree unrooted-tree.qza \
  --o-rooted-tree rooted-tree.qza

10、需要先准备一个metadata文件，文件说明参考：https://docs.qiime2.org/2019.7/tutorials/metadata/

11、计算核心多样性

qiime diversity core-metrics-phylogenetic \
  --i-phylogeny rooted-tree.qza \
  --i-table table.qza \
  --p-sampling-depth 500 \
  --m-metadata-file sample-metadata.tsv \
  --output-dir core-metrics-results

分析结果包含：

• α多样性

• 香农(Shannon’s)多样性指数（群落丰富度的定量度量，即包括丰富度richness和均匀度evenness两个层面）

• Observed OTUs（群落丰富度的定性度量，只包括丰富度）

• Faith’s系统发育多样性（包含特征之间的系统发育关系的群落丰富度的定性度量）

• 均匀度（或 Pielou’s均匀度；群落均匀度的度量）

• β多样性

• Jaccard距离（群落差异的定性度量，即只考虑种类，不考虑丰度）

• Bray-Curtis距离（群落差异的定量度量）

• 非加权UniFrac距离（包含特征之间的系统发育关系的群落差异定性度量）

• 加权UniFrac距离（包含特征之间的系统发育关系的群落差异定量度量）

β多样性分析结果-PCoA：

12、Alpha多样性组间显著性分析和可视化

qiime diversity alpha-group-significance \
  --i-alpha-diversity core-metrics-results/faith_pd_vector.qza \
  --m-metadata-file sample-metadata.tsv \
  --o-visualization core-metrics-results/faith-pd-group-significance.qzv

qiime diversity alpha-group-significance \
  --i-alpha-diversity core-metrics-results/evenness_vector.qza \
  --m-metadata-file sample-metadata.tsv \
  --o-visualization core-metrics-results/evenness-group-significance.qzv

13、绘制稀疏曲线

qiime diversity alpha-rarefaction \
  --i-table table.qza \
  --i-phylogeny rooted-tree.qza \
  --p-max-depth 1000 \
  --m-metadata-file sample-metadata.tsv \
  --o-visualization alpha-rarefaction.qzv

--p-max-depth参数的值应该通过查看上面创建的table.qzv文件中呈现的“每个样本的测序量”信息来确定。一般来说，选择一个在中位数附近的值似乎很好用。

14、物种组成分析

下载物种注释数据库制作的分类器：

wget \
  -O "gg-13-8-99-515-806-nb-classifier.qza" \
  "https://data.qiime2.org/2018.11/common/gg-13-8-99-515-806-nb-classifier.qza"

物种注释和可视化

qiime feature-classifier classify-sklearn \
  --i-classifier gg-13-8-99-515-806-nb-classifier.qza \
  --i-reads rep-seqs.qza \
  --o-classification taxonomy.qza

qiime metadata tabulate \
  --m-input-file taxonomy.qza \
  --o-visualization taxonomy.qzv

生成物种组成柱状图：

qiime taxa barplot \
  --i-table table.qza \
  --i-taxonomy taxonomy.qza \
  --m-metadata-file sample-metadata.tsv \
  --o-visualization taxa-bar-plots.qzv