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教材 Molecular biology of the gene 7th edition  J.D. Watson et. al

转录机制

一、RNA聚合酶和转录周期

1、

  • 细菌:一种转录酶
  • 真核:三种转录酶(植物+2种)
    • Pol I   大核糖体RNA前体
    • Pol II  几乎转录所有蛋白质编码
    • Pol III tRNA,小的核RNA基因,5S人RNA基因
    • (Pol IV、V 植物中,参与转录小干扰RNA)

细菌聚合酶的核心酶可独立合成RNA

  • 2 * α + β + β'大亚基 + ω
  • 酶的形状像个蟹爪
  • 钳子基部有活性中心裂隙
    • 依靠双金属离子催化合成反应
    • 位点结合一个Mg2+
    • 另外一个离子随人NTP进入随PPi释放
  • 酶上有多种通道

2、由RNA聚合酶进行的转录是由一系列步骤完成的

  • initiation

    • promoter 最初结合RNA聚合酶的序列
  • elongation
    • 合成了10个碱基以后,便进入延伸阶段
  • termination

3、转录的起始包含三个定义明确的步骤

  • 闭合复合体的形成

    • 双链状态
    • 聚合酶结合在一个面上
  • 转变为开放复合体
    • 双链在起始位点13bp距离内形成转录泡
    • 此时复合体叫:转录起始复合体(initial transcribing complex)
    • 最初10bp合成效率相当低,会不断合成小片段释放
    • 合成超过10bp,聚合酶逃离启动子
  • 启动子逃离,进入转录起始阶段

原核的转录

二、细菌的转录周期

1、细菌的启动子在强度和序列上是多样的

  • 原则上细菌RNA聚合酶核心酶可以在DNA分子的任意一点开始转录

    • 但是聚合酶不能打开双链
  • 但是在细胞内 ,有σ起始因子的参与,聚合酶只在启动子处转录
  • σ + 核心酶 = 全酶(holoenzyme)

细菌启动子元件有不同的组合情况

  • 大肠杆菌最常见的σ因子是σ70 具有如下特征

    • 两段6核苷酸长的保守序列

      • -10, -35
    • 被长度17-19bp的非特异性序列隔开
  • 启动的蛋白所识别的共有序列越相近,启动子越强
    • 单位时间内转录产物越多
  • 启动子的强度 与以下因素相关
    • 启动子最初与聚合酶的结合程度
    • 异构化作用的支持效率
    • 此后聚合酶逃离的难易程度
  • 这解释了表达水平的差异
  • 较强的启动子中(如指导rRNA)有UP-element
    • 提供额外的特异性
  • 缺失-35区的σ70拥有上游延长-10区,以补偿
    • 大肠杆菌gal基因
  • -10下游有鉴别子(discriminator)(都有??)
    • 与聚合酶作用影响稳定性

2、σ因子介导聚合酶与启动子的结合(形成闭合复合体)

    • σ70 有4个结构域
  • -35 被区域4的两个螺旋形成 helix-turn-helix识别
  • 一个插入-35 大沟,与碱基作用
  • 另一个从大沟顶部横穿过,与骨架接触
  • 与-35的结合提供能量确保聚合酶-启动子结合
  • 这一种motif结构见于很多DNA结合蛋白(转录激活、抑制因子)
  • -10 被区域2α螺旋识别

    • 螺旋包含几个芳香氨基酸
    • 可以与非模板链相互作用维持解旋DNA的稳定(类似SSB)
    • 区域2结合一个单链状态的-10element
    • 非模板链链上的两个碱基插入σ的口袋中
  • -10 的延长序列被结构域3识别
  • 鉴别子由结构域1、2识别
  • UP-element 不被 σ 识别,被α亚基羧基端αCTD识别
  • 区域3.2被称为3/4连接区

3、向开放式复合体的转变涉及RNA聚合酶和启动子DNA的结构变化

  异构化作用(isomerization)

  • 异构化作用不需ATP ,依靠优势构相驱动
  • 异构化不可逆,开放式复合体形成后,转录随后起始
    • 相反,闭合式复合体的形成是可逆的

  • 在活性中心内,DNA从+3位置开始分离
  • 聚合酶后的上游DNA在-11位置重新恢复双链
  • σ因子 N 端(1.1)起到分子模拟物(molecular mimic)的作用(+电)

    • 结合DNA前,是1.1结合在活性中心

4、转录由RNA聚合酶起始,不需要引物

  • 聚合酶需与一条或多条DNA模板链,起始核苷酸以及第二个核苷酸建立特异性作用
    • 严格控制方向
  • 大多数转录物以同一核苷酸开始
  • σ的3/4linker 与模板链互作,,确保正确位置和构象启动转录

5、转录的起始阶段RNA聚合酶保持位置不变,并将下游DNA拉向自己

  • 三种模型

    • 瞬时漂移
    • 蠕虫移动
    • 蜷缩

  • 单分子实验(FRET)支持蜷缩模型

    • 聚合酶下游的DNA被酶拉进来,在内部形成泡结构

6、启动子的逃离涉及聚合酶-启动子相互作用 以及

  聚合酶核心-σ相互作用的破坏

  • 一旦合成长度达到10bp,转录物变要穿入酶的RNA出口通道
  • σ3/4作为分子模拟物占据RNA出口通道
  • 合成达到10bp,RNA链便将σ3/4逐出
  • σ也常常会从延长酶上丢失
  • 逃离后,转录泡从22-24bp缩小为12-14bp
    • 这会释放能量,让聚合酶离开启动子并驱逐σ因子

有些生物如大肠杆菌噬菌体T7是单亚基聚合酶,没有σ因子,但也有类似的结构变化以让合成超过10bp的RNA穿出RNA通道

7、延伸聚合酶是一个边合成边校对的机器

  • 增长中的RNA有8-9个碱基与DNA保持互补
  • 聚合酶每前进相当于单核苷酸长度的一步,3'端添加一个核苷酸
  • 转录泡的大小不变

转录酶的校对机制(proofreading)

  • 焦磷酸编辑 pyrophosphorolytic editing

    • 是rNTP合成的逆反应
    • 错配导致合成速度减慢(空间位点不正确)
    • 聚合酶利用空间结构特性短暂限制PPi的离开
    • PPi + RNAn = RNAn-1 + rNTP
  • 水解编辑 hydrolytic editing
    • 聚合酶倒退入rNTP进入通道(利用环境中的热,0°C不发生,37°C发生)
    • Gre因子(E.coli)、TFIIS(真核)进入
    • 水解

8、聚合酶可能会因为模板损伤停滞不前,需要被挪走

  TRCF挪走停滞的聚合酶,并且招募修复酶

  • TRCF结合上游双链(依靠ATP),并且寻找到停滞的RNA聚合酶
  • 推动聚合酶向前合成,或者令三重复合体解离
  • 招募转录藕联修复酶(UvrA、B、C)

9、转录由RNA序列内部信号停止

  • Rho依赖型
    • Rho(ATP依赖)从rut位点结合单链
    • 寻找聚合酶
    • 将RNA扯出,或像TRCF一样作用

Rho的结合有特异性:

  • Rut位点理想:40bp,不折叠为二级结构,富含C
  • 不结合正在翻译的RNA
    • 故在细菌中,是等转录超过一个基因(编码序列)后才终止的

最近研究显示Rho因子是通过转录循环早期与RNA聚合酶结合

随着转录易位

易位导致紧绷

到一定程度,将酶终止

  • Rho非依赖型
    • 非依赖型终止子也称固有终止子(intrinsic terminator)
    • 组成
      • 反向重复序列
      • 8个U
    • 形成发夹,引发相关信号,转录物脱离

真核的转录

三、真核生物的转录

  • 真核生物的转录除了需要聚合酶外,还需要通用转录因子General transcription factor,GTF
  • 在体内,由于有核小体,转录还需要
    • DNA结合调节蛋白
    • 中介蛋白复合体
    • 染色质修饰酶

1、RNA聚合酶II的核心启动子由4个不同序列的元件构成

  • TFIIB识别元件
  • TATA元件
  • 起始子(Inr)
  • 下游启动子元件(包括DPE、DCE、MTE)

  核心启动子之外,存在的在体内进行有效转录所需的其他序列元件。共同组成调节序列

  • 启动子最近元件(promoter proximal element)
  • 上游激活物序列(upstream activator sequence,UAS)
  • 增强子
  • 沉默着子
  • 边界元件
  • 绝缘子

2、RNA聚合酶II在启动子上和通用转录因子形成前起始复合物

  • TFIID由TBP(TATA Binding Protein)与TAF(TBP Associated Factor)组成
  • TFIID 的TBP 识别TATA box
  • 真核的启动子解旋需要TFIID的ATP水解介导
  • 还需要聚合酶CTD磷酸化

3、启动子的逃离需要聚合酶的尾巴磷酸化

  • Pol II 的CTD由连续重复7肽序列
    • Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser
    • 每个重复序列都有激酶磷酸化位点
    • TFIIH的一个亚基由激酶功能

4、TBP用插入双螺旋小沟的β折叠来结合并扭曲DNA

  • 结合的特异性来自插入到识别序列两端的碱基对,这由驱动DNA发生强烈弯曲的两对苯丙氨酸的侧链实现

5、其他通用转录因子在起始中也有特殊作用

6、体内的转录需要其他蛋白的参与,包括中介蛋白复合体

聚合酶的CTD尾巴结合有mediator,它有助于聚合酶分子定位到启动子

  • mediator的一个表面结合Pol II CTD尾巴
  • mediator另外的表面结合其他起始因子
  • 如果缺失中介蛋白,常会导致一些基因失去表达
  • 中介蛋白把聚合酶定位到不同的启动子上

  • 在TFIIH水解ATP的介导下,双链打开,转录起始
  • 加帽酶5’端加帽

7、一组新的因子激发Pol II 延伸 和RNA校对(proofreading)

  • NELF :负延伸因子
  • DSIF :DRB敏感因子
  • 它们抑制早期转录,使得转录在+25 ~ +60处停止
  • P-TEFb会使得重新开始转录

8、聚合酶延伸过程中对抗组蛋白的阻碍

  • FACT 通过暂时挪开一个H2A·H2B二聚体方便转录

9、延伸聚合酶与各种RNA加工所需的一组新蛋白质相互作用

  • 5'端加帽
  • 转录poly-A信号
  • 相关蛋白募集
    • CSTF
    • CPSF
  • 切割
  • 多聚腺苷酸化
  • 终止
    • 鱼雷模型较受认可
    • Rat快速消化正在合成的5'没有帽的RNA
    • 达到聚合酶时,将RNA链扯出消化

四、由聚合酶I和聚合酶III催化的转录

1、聚合酶I 聚合酶III识别不同的启动子,但仍需TBP

2、Pol I 只用于转录RRNA基因

  • UBF结合UCE
  • 引入SL1(由TBP与TAF组成)
  • 募集Pol I 至核心启动子,激发转录

3、Pol III 的启动子位于转录起始点的下游

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