微生物组学数据分析工具综述 | 16S+宏基因组＋宏病毒组＋宏转录组--转载

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建立在高通量测序基础上的微生物群落研究，当前主要有三大类：基于16S/18S/ITS等扩增子做物种分类的Metataxanomics、鸟枪法打断全基因组DNA序列的Metagenomics和基于mRNA信息的宏转录组方法Meta-transcriptomics。

16S，也即是我们通常所说的微生物多样性，是一种相对快速和经济适用的方法，但是PCR导致了偏好的产生，这就降低了注释准确度。此外，由于原核、真核生物的“分类标签”完全不同，即使细菌和古菌的16S也相去甚远，以进化快著称的病毒更难以捕获。宏基因组有效避免了扩增偏差，由于是直接打断，理论上不限制物种（细菌、真菌、古菌、真核生物等，事实上当前宏基因组测序多还是以细菌为主），可能组装获得新基因乃至新物种信息，但根据取样情况可能存在少量或大量的宿主污染，因需组装，数据量要求大，成本贵、周期长。宏转录组的好处是，跳出了DNA层面的束缚，可以获得实时活跃的、真正对群落有贡献的基因和通路，然而mRNA不如DNA稳定,此外多纯化和扩增的步骤也可能引入错误。

表1 三种技术的选择策略

关于16S的全流程，我在生信者言的千聊直播间里和大家做过系列课程分享，ppt可联系小秘书Anymore（微信号：genegogo007）获取，另外，专门针对16S的生信分析，也给大家做过一个详细的工具单和点评：《9个模块＋40余款软件＋老司机辣评 | 16S信息分析流程软件和数据库合集》。这里就不具体展开讲了。

下面来说说大家关注的宏基因组。宏基因组这部分，生信者言李木子童鞋也曾经给大家做过系统梳理和点评：《精选30余款宏基因组分析软件，来自老司机的使用经验总结（上篇）》、《精选30余款宏基因组分析软件，来自老司机的使用经验总结（中篇）》、《精选30余款宏基因组分析软件，来自老司机的使用经验总结（下篇）》、《句句干货！一文读懂宏基因组binning》。

在17年发表于Briefings in Bioinformatics的一篇题为《A review of methods and databases for metagenomic classification and assembly》的综述中，也有很多可参考的思路和软件汇总。

宏基因组经典流程：环境微生物样本--Total DNA提取--文库构建--上机测序（经典短读长: illumina系列；长读长选择: PB, ONT）--数据质控（去除低质量和接头等，去除宿主基因组等干扰信息）--宏基因组组装--Contig Binning--基因组重建--分类注释（可基于reads、contig、bins、还原出来的基因组做物种注释）--其他下游分析。

质控常用工具列表：

分类注释工具汇总：

组装和binning工具汇总：

嫌软件太多、想要主流软件推荐和评测的童鞋，可以转回去看上一段给大家写出来的来自李木子老师的流程软件评测文。

此外，再给大家推荐两个流程集成软件，MetAMOS ( https://github.com/marbl/metAMOS ) 和MOCAT2 ( https://github.com/mocat2/mocat2 ) ，有兴趣的小伙伴可以试用下。

下面我们再扩展一下，如何从宏基因组数据中鉴定病毒序列？15年PeerJ上介绍了一个适用于组装后contig集中病毒序列识别的工具--Virsorter ( https://github.com/simroux/VirSorter )，同年发表在Nucleic Acids Research上的另一篇文章提出了一个能把细菌和病毒序列分别识别鉴定出来的软件--GOTTCHA ( Genomic Origins Through Taxonomic CHAllenge)。16年Microbiome上又报道了一款比Virsorter更适合短contig、真阳性更高的软件--VirFinder ( https://github.com/jessieren/VirFinder )，这块软件主要通过利用细菌和病毒在Kmer上的差异将病毒从宏基因组序列中抽离出来。此外，宏病毒组也有流程集成类软建，如16年发表于BMC genomics的ViromeScan ( https://sourceforge.net/projects/viromescan/ )和15年发表于Scientific Reports上的VIP ( https://github.com/keylabivdc/VIP )等。

再说说宏转录组，东拼西凑的日子不好过，现在宏转录组也迎来了自己的专属软件--IMSA+A ( https://github.com/JeremyCoxBMI/IMSA-A )。IMSA+A在17年1月发表于Microbiome，是一种可应用于任意读长宏转录组学数据、可高效在同一份样品中鉴定出细菌、真菌、病毒的准确的分类分析的方法。

事实上，在微生物组学研究中，往往不会只使用一种检测方法，多组学联用几乎是各大研究论文必备杀器。宏转录组的单独应用就更少，多需和宏基因组结果结合起来分析。现在的方法多是各组学单独分析，从基因集和功能注释结果做比较，但这样其实并未解决不同组学天上地下十万八千里的误差，算作联合分析也比较牵强。

16年底，卢森堡大学Paul Wilmes发表于Genome Biology的一篇Method介绍了一款神器--IMP。IMP把整合宏基因组和宏转录组40多个工具整合在同一个平台上，使用 docker  engine 驱动以确保多系统的兼容性和可重复性。IMP重复性好，同时非常灵活方便，适用于很多宏基因组plus课题，而且相较MOCAT和MetAMOS能提供更多目标基因，给后续其他组学（如宏蛋白组学）研究提供更好基础。

在当年的冷泉港会议上Dr. Paul Wilmes也做了多组学联合分析（MuSt）的工具流程（IMP）的报告，有兴趣的小伙伴可以测试下，IMP的home在这里：http://r3lab.uni.lu/web/imp/。

微生物组学研究正处在井喷期，研究工具也更新换代的很快，这里总结的，仅可算沧海一粟。欢迎大家留言回复你的使用偏好和心得，或来微信讨论群里一起头脑风暴！

参考文献：

1. A review of methods and databases for metagenomic classification and assembly.

2. MetAMOS: a modular and open source metagenomic assembly and analysis pipeline.

3. MOCAT2: a metagenomic assembly, annotation and profiling framework.

4.  VirSorter: mining viral signal from microbial genomic data.

5. Accurate read-based metagenome characterization using a hierarchical suite of unique signatures

6. VirFinder: a novel k-mer based tool for identifying viral sequences from assembled metagenomic data.

7. ViromeScan: a new tool for metagenomic viral community profiling.

8. VIP: an integrated pipeline for metagenomics of virus identification and discovery.

9. A fast and robust protocol for metataxonomic analysis using RNAseq data.

10. IMP: a reproducible pipeline for reference-independent integrated metagenomic and metatranscriptomic analyses.