RNA提取和建库流程对mRNA-Seq的影响

已有 10460 次阅读 2014-8-14 14:21 |个人分类:转录组测序|系统分类:科研笔记|关键词:转录组测序,RNA-Seq,,链特异性RNA-Seq,转录组文库构建,总RNA提取| RNA-seq转录组测序链特异性RNA-Seq转录组文库构建总RNA提取

 

目前RNA-Seq是挖掘不同生长时期及不同胁迫条件下、不同组织细胞中其差异表达基因通常所采用的研究方法,同时还可以鉴定获得新的转录本信息以及不同的可变剪切事件,因而RNA-Seq目前应用很广泛。结合不同的RNA提取方法及文库构建流程对RNA-Seq获得的测序数据产生不同的影响。

1.关于总RNA提取

关于RNA提取对于大家最为熟悉的是Trizol-based的RNA提取方法,也有结合试剂盒来进行提取的。在提取总RNA的过程中通常会引入影响后续PCR酶促反应的抑制剂等,这些抑制剂如不正确去除的话,会对后续的反转录、末端修复、加A以及接头连接和PCR扩增等产生影响,如阻碍聚合酶的聚合、影响聚合酶的活性甚至降解聚合酶等,从而对最终获得的测序数据造成影响。

样本中常见的抑制剂包含由样本中本身就带有的和在实验操作过程中带入的,样本中本身包含的抑制剂如血液中的血红蛋白,植物样本中的腐殖酸、黄腐酸等;在实验过程中带入的抑制剂如EDTA、肝素、氯酚仿等。不同样本中可能引入的抑制剂或其他污染物会不一样,详见DNA/RNA Isolation Considerations When Using TruSeq Library Preparation

如果样本中存在这些抑制剂等污染物质的话,需结合试剂盒进一步进行纯化,比如过柱子过滤的试剂盒等,达到总RNA理想标准方可开展后续实验。

总RNA提取结果检测标准:

总RNA溶解环境:ph7.5-8.0;

结合Qubit or Pico/RiboGreen/Agilent 2100进行检测;

Substance                                          Absorbance (nm)             260/280 Ratio Values     260/230 Ratio Values

Pure DNA                                             280 nm                                 ~1.8                                       2.0–2.2

Pure RNA                                             280 nm                                 ~2.0                                       2.0–2.2

EDTA, Carbohydrates, Phenol             230 nm                                 < 1.5                                      < 2.0

Guanidine HCL                                    230 nm                                 < 1.5                                      < 2.0

2.关于去除rRNA

考虑到总RNA中含有大量的rRNA序列,大约是在80%-90%的序列是rRNA,因而会结合不同的方法来去除总RNA中的rRNA。真核生物种常规的去除rRNA的方法是通过oligo(dT)富集带有polyA尾的mRNA来实现的,但是这种方法针对不含有polyA尾的转录本序列以及存在部分降解的总RNA样本,所以这种方法针对FF(Formalin-Fixed)样本和FFPE(Paraffin-Embedded)石蜡包埋样本是不适用的,否则对获得样本中最全面的转录本信息会产生显著影响。

针对于FF和FFPE样本以及原核生物的总RNA中去除rRNA,则需结合RiboZero、RiboMinus等是结合来开展去除,其实针对rRNA序列进行杂交捕获去除的原理来去除的。针对FFPE样本还有结合双链特异性核酸酶构建文库来降低后续测序数据中的rRNA序列比例的。

常见去除rRNA方法:

a. rRNA消减杂交法:相应的试剂盒有MICROBExpress bacterial mRNA enrichment kit (Ambion),RiboMinus bacteria transcriptome isolation kit (Invitrogen) 和Ribo-Zero rRNA removal kit (Epicentre);

b. 5′单核苷酸依赖的外切酶处理法:相应的试剂盒主要有mRNA-ONLY prokaryotic mRNA isolation kit (Epicentre);

c. 选择性引物扩增法:相应试剂盒主要有Ovation prokaryotic RNA-seq system (NuGEN);

d. 依赖于双链特异核酸酶的cDNA均一化法:相应的试剂盒主要有trimmer-direct cDNA normalization kit(Evrogen);

e. 大肠杆菌 poly(A)聚合酶加尾法:相应的试剂盒有MessageAmp II-bacteria kit (Ambion);与RNA结合蛋白Hfq 等免疫共沉淀法,由于Hfq 能够高效地结合small RNA,并能辅助它们与靶标mRNA结合,因此常用于small RNA及其靶标mRNA 的研究。

3. 关于文库构建

针对去除rRNA之后获得的mRNA进行构建文库,通常有两种思路:

a. 先对mRNA结合oligo(dT)进行反转录,再针对cDNA进行fragmentation;

b. 先mRNA fragmentation再结合随机引物进行反转录。

这两种方法获得的结果会有很多差异:a.蓝线;b.红线。

上图显示先针对mRNA进行打断再进行反转录获得测序reads主要是针对基因本体的;若先反转录,尤其是结合oligo(dT)进行反转录获得的测reads对转录本3'端具有比较强的偏好性,所以在mRNA-Seq中建议采用先对mRNA打断再进行反转录的文库构建方法。

根据mRNA文库构建类别,又分为常规的mRNA文库构建、均一化文库构建(引入双链特异性核酸酶)、全长cDNA文库以及链特异性文库构建(引入dUTP替换合成第二链中的dTTP)等,需根据具体的研究目的来选择,均一化文库构建可获得文库中低丰度表达基因信息、链特异性文库可获得正反向链上的转录本信息及可变剪切信息等。

Macrogen 千年基因针对结合NGS平台测序RNA文库要求等详细信息汇总如下:

*上述表格针对总RNA以及mRNA、病毒ssRNA的情况均有列出,供参考。

附参考文献(如有什么问题欢迎随时**我ttwu@macrogencn.com,谢谢!):

1.Influence of RNA extraction methods and library selection schemes on RNA-seq data

2.IVT-seq reveals extreme bias in RNA-sequencing

3.Ribosomal RNA depletion for massively parallel bacterial RNA-sequencing applications

4.Comprehensive comparative analysis of RNA sequencing methods for degraded or low input samples

5.illumina support

6.Macrogen 千年基因support

7.Prokaryotictranscriptomics: a new view on regulation, physiology and pathogenicity

8. Efficientand robust RNA-seq process for cultured bacteria and complex communitytranscriptomes

9.Aperspective: metatranscriptomics as a tool for the discovery of novelbiocatalysts

10.Deepsequencing analysis of small noncoding RNA and mRNA targets of the globalpost-transcriptional regulator

11. Globalanalysis of small RNA and mRNA targets of Hfq

12.Validationof two ribosomal RNA removal methods for microbial metatranscriptomics

13.RNA-Seq a revolutionary tool for transcriptomics.pdf

RNA提取和建库流程对mRNA-Seq的影响的更多相关文章

  1. Gerrit+apache+H2数据库简单安装配置及建库流程

    Gerrit 是一个基于 Web 的代码评审和项目管理的工具,面向基于 Git 版本控制系统的项目.因此需要Apache.Mysql.GIT等相关软件的支持 系统配置: 新装的UBANTU LINUX ...

  2. Git 实用基础(配置,建库,提交,推送 GitHub)

    Git 实用基础(配置,建库,提交,推送 GitHub) SVN ? Git ? 目前市面上主流的版本控制系统就是 SVN 和 Git . 两者的区别简单通俗地说就是,版本数据是否有在本地. 如果觉得 ...

  3. MySQL 建库、建用户及建表事项

    1,MySQL建库语句比较简单,一句话: create database tppamltest3 2,创建用户及授权: insert into mysql.user(Host,User,Passwor ...

  4. 基于ArcEngine的空间数据通用建库软件介绍

    最近花了点时间把之前的空间数据入库功能进行了完善,在这里做一个简单的介绍,也希望大家给提点意见和建议,我的目标是做一个好用.易用.通用.稳定的入库程序. 1.软件特点: 基于模板(方案)的数据更新   ...

  5. ArcGIS农村土地承包经营权辅助建库软件说明书

    软件作者:闫磊  电话:18987281928 或13108507190 QQ:853740877,QQ交流群:236352926 1.    软件安装... 4 2.           系统整体界 ...

  6. AIX下RAC搭建 Oracle10G(六)dbca建库

    AIX下RAC搭建系列 AIX下RAC搭建 Oracle10G(六)dbca建库 环境 节点 节点1 节点2 小机型号 IBM P-series 630 IBM P-series 630 主机名 AI ...

  7. 【Oracle】 手工建库

    操作系统:OEL 5.6 数据库版本:Oracle11gR2  11.2.0.4.0 新建数据库名称:lgr 1 生成pfile和口令文件 1)生成pfile文件,在模板文件init.ora中提取 [ ...

  8. ArcMap从建库到出图

    1前言 本篇博主将介绍关于ArcMap建库.数据采集.拓扑检查.图表.制作符号等的基本操作. 2问题阐述 (1)检查现有block(线要素)图层,保证所有要素闭合,并将其转换为parcel(面要素): ...

  9. Vertica 安装,建库,新建测试用户并授予权限,建表,入库

    测试环境:RHEL 6.4 + Vertica 6.1.3-7 需求:搭建Vertica数据库3节点的测试环境,建立测试用户,建表,测试数据入库. 1.各节点关闭防火墙和SELinux,配置主机名,I ...

随机推荐

  1. C++笔记(1)

    C++笔记1文件与流笔记 参考博客: https://blog.csdn.net/kingstar158/article/details/6859379       关闭文件中: 当文件读写操作完成之 ...

  2. 域名到站点的负载均衡技术一览(主要是探讨一台Nginx抵御大并发的解决方案)(转)https://www.cnblogs.com/EasonJim/p/7823410.html

    一.问题域 Nginx.LVS.Keepalived.F5.DNS轮询,往往讨论的是接入层的这样几个问题: 1)可用性:任何一台机器挂了,服务受不受影响 2)扩展性:能否通过增加机器,扩充系统的性能 ...

  3. Android之sqlite数据库版本升级和降级的处理(onUpgrade和onDowngrade)

    一.SQLite升级和降级需要考虑的细节 ①  SQLite升级: v3.0数据库版本 [onUpgrade 情况:n-1,onCreate 情况:1]                        ...

  4. 报错:Failed to execute goal org.apache.maven.plugins:maven-compiler-plugin:3.1

    错误现象: Failed to execute goal org.apache.maven.plugins:maven-compiler-plugin:3.1:compile (default-com ...

  5. keil5 MDK warning:registered ARM compiler version not found in path

    重装 打开keil5弹出窗口: warning:registered ARM compiler version not found in path... 解决: 增加系统环境变量 ARMCC5LIB ...

  6. 1DAY centos 7.4 u盘安装、网络安装

    0xff01 重庆大学开源下载centos 1.下载地址 http://mirrors.cqu.edu.cn/CentOS/7.4.1708/isos/x86_64/  选择 CentOS-7-x86 ...

  7. dubbo文档

    Srping版Dubbo集成中文地址: https://dubbo.gitbooks.io/dubbo-user-book/content/preface/background.html Spring ...

  8. Java 学习 UUID 与 时间格式化、时间操作

    UUID : UUID 是 通用唯一识别码(Universally Unique Identifier)的缩写,是一种软件建构的标准,亦为开放软件基金会组织在分布式计算环境领域的一部分.其目的,是让分 ...

  9. python下selenium自动化测试自我实践

    周末实验自动化提交数据时,本来没打算写记录的,不过遇到一些问题,觉得可以提提.基本操作就不用写了,搜索过程中都发现了两个博客都出了selenium+python的书,说明操作一搜一大把. 1. 等待页 ...

  10. Maven CXF wsdl2Java List<Xxx>生成ArrayOfXxx包装对象 解决方法

    添加-xjc-Xxew解决,同时还要给插件添加相应的jar包,如下: <plugin> <groupId>org.apache.cxf</groupId> < ...